همه‌ی نوشته‌های y7oozita

منابع و ماخذ پایان نامه ژنتيکي، بررسي، مارکر

ي ،تقسيم کننده هستند که يک خوشه بزرگ را که در برگيرنده همه اطلاعات ميباشد را در داخل گروههاي کوچکتر تقسيم ميکنند و اين فرايند را تا آنجا تکرار ميکنند تا اينکه تمام خوشهها تقسيم شود. ديگر روشهاي ردهبندي داراي خاصيت تراکمسازي هستند و برمبناي پيدا کردن اقلام مشابه استوارند بدين طريق که ابتدا مشابهترين جنس در يک خوشه قرار ميگيرد و سپس اقلام مشابهتر به آن خوشه افزوده ميشود تا اينکه تمامي اقلام در يک خوشه بزرگ مجزا گنجانيده شوند (31). روشهاي ردهبندي داراي خاصيت متراکمسازي در علوم طبيعي بيشتر متداولاند. نتايج حاصل از تجزيه و تحليل خوشهاي توسط دندروگرام مشخص ميکند که اقلام اوليه در چه سطحي از شباهت درون خوشههاي مجزا قرار گرفتهاند . محور x ميزان شباهتها و فاصلهها را نشان ميدهد، خوشهها ممکن است 2 به2 (جفت جفت) به همديگر متصل شوند و متناوباً شاخههاي بعدي به خوشه موجود افزوده شوند اين گونه پيوستن متوالي از نمونههاي انحصاري ، به صورت زنجيرهاي صورت ميگيرد که البته مشکل اساسي اين روش اثر زنجيرهاي ميباشد که تفسير و تشخيص گروههاي حاصل را مشکل ميسازد. تعيين تعداد گروههاي اصلي در آناليز خوشهاي اغلب هدف عمده ما محسوب ميشود . به طور کلي يک روش براي گروهبندي دادهها تعريف ميشود که بر اساس طول شاخههاست ، گاهي اوقات گروهبندي شاخهها بر اساس سطح ثابتي از تشابه تعريف ميشود به طوريکه يک خط در يک سطح انتخاب شده از تشابه ترسيم ميشود و تمام شاخههائي که اين خط را قطع کردهاند ، نشان دهنده يک گروه مجزا ميباشند(32).
1-15-2 تجزيه خوشهاي:
تجزيه خوشهاي روشي مناسب براي گروهبندي افراد مي باشد، به طوري كه اولاً افراد هر گروه با در نظر گرفتن خصوصيات ويژهاي، مشابه باشد و ثانياً هر گروه بايستي از لحاظ همان خصوصيات مشخص با گروه ديگر تفاوت داشته باشد. با اين مفهوم كه مشاهدات درون يك گروه با مشاهدات گروه ديگر تفاوت داشته باشد. مفهوم واژه تشابه به اهداف تحقيق بستگي دارد و در هر تجزيه بايستي تعريف شود.
1-15-3 ضريب شباهت:
اولين مرحله در تجزيه كلاستر، انتخاب نوع معيار فاصله يا شباهت ژنتيكي است. فاصله يا شباهت ژنتيكي بين ژنوتيپها يا جمعيتها ميتواند بسته به نوع صفات مورد مطالعه و دادههاي حاصله، با استفاده از روشهاي مختلف برآورد شود. در مورد دادههاي حاصل از صفات كمي فاصله اقليدسي از متداولترين معيارهاي برآورد فاصله ژنتيكي است. براي صفات كيفي يا دادههاي نشانگر كه به صورت يك و صفر بيان مي گردند، ضرايب متعددي براي برآورد فاصله يا شباهت ژنتيكي استفاده ميشوند كه مهمترين آنها عبارتنداز: ضريب شباهت جاكارد، ضريب ني و لي، ضريب تطابق ساده (58).
1-15-4 انتخاب الگوريتم:
مرحله دوم انتخاب نوع الگوريتم جهت كلاستر بندي است. الگوريتمهاي متعددي براي تجزيه كلاستر پيشنــهاد شدهاند. اين الگوريتمها به دو گروه اصلي تقسيم ميشوند: 1-روشهاي مبتني بر فاصله كه فاصله يا شبـاهت دو به دو افراد يا ژنوتيـپها جهت گروهبندي محاسبه ميشود2- روشهاي مبتني بر مدل كه فرض بر اين است كه افراد درون هر كلاستر، مشاهدات تصادفي از برخي مدلهاي پارامتري بوده و استنباطات آماري مربوط به پارامترهاي هر كلاستر و تعيين عضويت در هر كلاستر با استفاده از روشهاي آماري استاندارد مانند حداكثر درشت نمايي و … انجام ميگيرد. در مطالعات ژنتيكي بيشتر از روشهاي مبتني بر فاصله، به خصوص روش اتصال ميانگين (UPGMA) استفاده ميشود، كه البته مشكل اساسي اين روش اثر زنجيرهاي است كه تفسير و تشخيص گروههاي حاصل را مشكل ميسازد (58).
1-16 بررسي كارآيي الگوريتم مورد استفاده در تجزيه كلاستر:
معيارهاي متفاوتي براي بررسي كارآيي الگوريتمهاي مختلف كلاستر استفاده ميشوند كه از متداول ترين آنها ميتوان به ضريب همبستــگي كوفنـتيك اشاره كرد. اين ضريـب، همبستگي بين ورودي) ماتريس شباهت و يا فاصله (و خــروجي (ماتريس كوفنتيك كه از دندوگرام بدست مي آيد(، تجزيه كلاستر را نشان ميدهد، كه مقدار آن بين 0 الي1 ميباشد. اگر اين ضريب بزرگتر يا مساوي 9/0 باشد، نشاندهنده كارآيي الگوريتم در گروهبندي است . با اين وجود در مورد دادههاي مولكولي ضريب پايين به مفهوم عدم كارآيي آن الگوريتم نيست بلكه نشاندهنده اختلال در دادهها به علت وجود دادههاي گمشده است. اگر9/0 r باشد برازش بسيار خوب است. اگر 9/0 r 8/0باشد برازش خوب است. اگر 8 /0 r 7/0 باشد برازش ضعيف است. اگر r کمتر از 7/0 باشد برازش بسيار ضعيف است (49).
1-17 شاخص شانون
يک اندازه‌گيري که بوم‌شناسان براي بررسي فراواني درجمعيت به کار مي‌برند شاخص شانون-واينر يا اطلاعات است. اين شاخص يک فرمول رياضي است که از نظريه‌ي اطلاعات گرفته شده است که به وسيله‌ي مهندسان براي تحيلي بازدهي انتقال داده در خط‌هاي تلفن توسعه يافته است. اين شاخص، H، با فرمول زير به دست مي‌آيد:
H=-Sigma Pi ln Pi
هر چند که پيچيده به نظر مي‌رسد، معني آن اين است که براي هر گونه نسبت (p) آن به کل را تعيين ميکنيد و سپس آن شماره را در لوگاريتم طبيعي آن عدد (ln) و خود آن عدد ضرب مي کنيم. تا اينجا p ln p به دست مي‌آيد. اين کار را براي هر گونه در اجتماع انجام مي‌دهيم و سپس همه‌ي شماره‌هاي به دست آمده را جمع مي‌کنيم. از آنجا که اين شماره منفي خواهد شد، براي آساني کار آن را مثبت مي‌کنيم. هر چقدر اين پارامتر بيشتر باشد نشان دهندهي فاصله و تمايز بيشتر در بين جمعيتهاست(28).
1-18 بررسي تنوع و تفاوت ژنتيکي بين جمعيتها براساس آناليز Nei
جهت کمي نمودن تمايز درون و بين جمعيتها از آناليز Nei استفاده ميشود که از سه ضريب متفاوت تشکيل شده است:
تنوع ژنتيکي کل جمعيتها HT
تنوع ژنتيکي درون جمعيت HS
تنوع ژنتيکي بين جمعيتي GST
اين سه برآورد به صورت زير به هم مرتبط هستند:
GST=(HT – Hs)/HT
نهايتا با استفاده از فرمول زير جريان ژني (Nem) نيز محاسبه ميگردد که متوسط مهاجرت در هر نسل را نشان ميدهد(28):
Nem=0.5(1 – GST)/GST
اين معيار براي اندازه گيري فاصله ژنتيكي بين جمعيت ها كاربرد فراواني دارد.
1- 19 سابقه تحقيق
1- 19- 1 مروري بر برخي پژوهشهاي علمي انجام شده بر روي Quercus brantii Lindl.
درحال حاضر عمده مطالعات صورت گرفته بر روي Quercus brantii Lindl. در داخل کشور، معطوف به ترکيبات، اسانس و اسيدهاي چرب و اثرات درماني بوده است. در اين گونه در رابطه با بررسي روابط فيلوژنتيکي توسط مارکرهاي مولکولي کارهاي بسيار کمي صورت گرفته است، مشايخي و همکاران در سال 1389 بهوسيله مارکرAFLP هشت جمعيت از Quercus brantii Lindl. در استان چهارمحال و بختياري را از لحاظ روابط ژنتيکي مقايسه کردند. نتايج آنها نشان داد که در استان چهارمحال و بختياري سطح بالايي از تنوع بين و درون جمعيتهاي بلوط ايراني وجود دارد(9).
ذوالفقاري و همکاران از تکنيکSSR براي بررسي تنوع و روابط ژنتيکي بين جوامع مختلف ارتفاعي بلوط ايراني در استان کهکيلويه و بوير احمد استفاده کردهاند و به اين نتيجه رسيدهاند که بلوط ايراني در اين جوامع از تنوع ژنتيکي بالايي برخوردار است و ارتفاع تاثير جالبتوجهي بر اين تنوع دارد. به طوري که جوامع مستقر در ارتفاعات پايينتر از لحاظ ساختار ژنتيکي تفاوت معنيداري با جوامع موجود در ارتفاعات بالاتر دارند و کمترين فاصلهژنتيکي نيز بين درختان طبقه ارتفاعي بالا و خيلي بالا وجود دارد و مارکر SSR به دليل پليمورفيسم بالايي که نشان داد مارکري کارآمد براي بررسي اين گونه از بلوط ميباشد(3).
از آنجايي که بلوط ايراني اندميک ايران و ترکيه ميباشد در خارج از کشور ايران هيچ مطالعهاي بر روي ژنوم و تنوع جمعيت بلوط ايراني انجام نشده است.
مطالعات ديگري نيز بر روي ساير گونههاي بلوطQuercus در بيشتر نقاط دنيا انجام شده است چرا که اين گياه از لحاظ اکولوژيکي، اقتصادي و … حائز اهميت است و همه اين تحقيقات نشانگر وجود تنوع ژنتيکي بالا در بين و درون جمعيتهاي بلوط ميباشد.(14و5)
1-19-2- مروري بر برخي پژوهشهاي انجام شده با استفاده از نشانگرSRAP
مارکر SRAP يک مارکر جديد است که تاکنون مطالعات زيادي در رابطه با اين مارکر در داخل کشور انجام نشده است.
عابديان و همکاران در سال 2012 تنوع بين گونهاي چند گونه از گيلاس را با استفاده از اين مارکر بررسي کردند که پليمورفيسم نسبتا بالايي را نشان داد و اين اولين گزارش مارکر SRAP در گيلاس بود(13). طالبي و همکاران نيز تنوع بينگونهاي چند گونه از پسته در ايران را با استفاده از اين مارکر بررسي کردند و پليمورفيسم بالايي را مشاهده نمودند(60).
در خارج از کشور مطالعات زيادي با استفاده از اين مارکر بر روي گياهان مختلف انجام شده است، لي وانگ و همکاران در سال 2008 تنوع ژنتيکي تربچه را با استفاده از مارکرهايSRAP، ISSR، RAPD ارزيابي کردند و درصد پليمورفيسم مارکرSRAP حدود 85% بود که مقداري قابلتوجه است(38).
يانگ و همکاران در سال 2012 با استفاده از اين مارکر تنوع ژنتيکي درون گونهاي درخت کنار را بررسي کردند که پلي مورفيسم بالايي را نشان داده و بسيار کارآمد بوده است(73).
يوجن و همکاران در سال 2010 با استفاده از اين مارکر و مارکرSSR تنوع ژنتيکي بين و درون جمعيتهايPogostemon cablin را در چين بررسي کردند. که در اين مورد نيز نتايج جالب توجهي به دست آمد و پلي مورفيسم خوبي را نشان داد(75).
زياوپنگ و همکاران در سال 2008 تنوع ژنتيکي گونه هاي ميخک را با استفاده از اين مارکر بررسي کردند(70).
گااو و همکاران در سال 2005 تنوع ژنتيکي بينگونه اي 22 گونه از Hedychium چيني را با استفاده از اين مارکر بررسي کردند و آنها را در 3 دسته طبقه بندي کردند و نقشه ژنتيکي آنها رسم شده است(22).
حمدي عمر و همکاران در سال 2011 تنوع ژنتيکي 24 گونه از Citrus را با استفاده از اين مارکر و مارکرهاي SSR و CAPS-SNP بررسي کردند و براساس نتايج مارکر SRAP کارآمدترين مارکر گزارش شد زيرا درصد پليمورفيسم آن از دو مارکر ديگر بيشتر بود(27).
وانگ و همکاران در سال 2011 تنوع ژنتيکي 68 گونه کرفس و گونههاي مرتبط با آن را با استفاده از مارکرهاي SRAP و SSR بررسي کردند. پليمورفيسم حاصله 95% بود که نشاندهندهي کارآمد بودن هر دو مارکرSRAP و SSR جهت بررسي کرفس و گونههاي مرتبط بود(67).
کاي و همکاران نيز در سال 2011 تنوع ژنتيکي و ساختار جمعيتي يک نوع ارکيده در حال انقراض را با استفاده از مارکر SRAP بررسي کردند درصد پلي مورفيسم81% درصد محاسبه شد و مشخص شد که اين گياه داراي تنوع ژنتيکي بالايي در سطح گونه است(17).
ييلديز و همکاران در سال 2011 از سه مارکر ISSR، RAPD و SRAP جهت بررسي تنوع ژنتيکي 63 ژنوتيپ هندوانه ترکي استفاده کردند. ميانگين درصد پليمورفيسم 90% بود که اين ميزان نسبت به مقادير قبلي به دست آمده در جهان بيشتر بود(74).
پنگ و همکاران نيز در سال 2008 تنوع ژنتيکي 23 جمعيت از گلرنگ ( (Carthamus tinctoriusو گونه هاي مرتبط با آن را با استفاده از مارکر SRAP بررسي کردند که پل مورفيسم نسبتا بالايي (57%) را نشان داد(46).
دانگ و همکاران در سال 2010 تنوع ژنتيکي 15 جمعيت نوعي از گندم سرخ وحشي در اسرائيل را با اين مارکر بررسي کردند و درصد پليمورفيسم 79% محاسبه شد(19).
شاو و همکاران در سال 2010 تنوع ژنتيکي 29 جمعيت گل داوودي را براساس مارکرهاي SRAP و ISSR بررسي کردند. پلي مورفيسم محاسبه شده توسط ISSR بيشتر از SRAP بود ولي با اين حال پليمورفيسم SRAP مقدار قابل توجهي (75%) بود(54).
ليو و همکاران در سال 2012 تنوع ژنتيکي 14 جمعيت وحشي از گرگتيغ (Lycium ruthenicum Murr) را با استفاده از اي

منابع و ماخذ پایان نامه پليمراز، توالي، دماي

درون جمعيتها استفاده ميشوند (12). ريزماهوارهها به دليل همبارز بودن و تبعيت از توراث مندلي و تشخيص آسان افراد هموزيگوس از هتروزيگوسي در بررسي تنوع ژنتيکي و انتخاب والدين برتر استفاده ميشوند (56). نشانگر SSR به دليل همبارز بودن و سطح بالاي چندشکلي و کاربرد آسان اين تکنيک، يک روش مناسب براي بررسي تنوع ژنتيکي به حساب ميآيد(18).
1-12-3-2-4 نشانگرISSR24:
زيتکيويز و همکاران در سال 1994 نشانگر مولکولي جديدي (مبتني بر PCR) به نام ISSR را معرفي کردند(76). اين تکنيک شامل تکثير قطعات DNA موجود در فواصل قابل تکثير بين دو توالي تکراري ريزماهواره است که در دو جهت مختلف آرايش يافتهاند. در اين نشانگرها معمولاً از ريز ماهوارههايي با طول 25-16 جفت باز به عنوان آغازگرهايي که در يک واکنش PCR مکانهاي ژنومي زيادي را مورد هدف قرار ميدهند استفاده ميکنند و به دليل طويل بودن آغازگرها، تکرارپذيري بالايي دارند، همچنين طول قطعات تکثيري با هم متفاوت ميباشند. تکرارهاي ريزماهواره که به عنوان آغازگر استفاده ميشوند، اصولاً دو، سه، چهار يا پنج نوکلئوتيدي ميباشند. اين آغازگرها مي توانند بدون باز اضافه (55،33و25) يا داراي 1 تا 4 باز اضافي به صورت لنگر در انتهاي ´3 يا ´5 باشند (76). نشانگرISSR تصادفي بوده و تکرارپذيري و چندشکلي بالايي دارد و در طيف وسيع از گياهان استفاده ميشود. ميزان تکرارپذيري در نشانگر ISSR بين 95-92 درصد است. بخصوص زماني که از ژل پلياکريلآميد استفاده گردد. اين تکنيک نيازمند اطلاعات اوليه در مورد توالي ژنوم نيست و الگوي چندشکلي زياد و چند لوکوسي ايجاد مينمايد. ميزان DNA مورد استفاده در اين تکنيک بسته به نوع گياه متفاوت و در حدود 10 تا50 نانوگرم ميباشد (43). نشانگرهاي ISSR، اغلب به عنوان نشانگرهاي غالب معرفي ميشوند که از قوانين توارث مندلي تبعيت ميکنند (66،56 و 25).
1-12-3-2-5 نشانگرSRAP25:
لي و کويروس در سال 2001 براي اولين بار نشانگر مولکولي جديدي به نام SRAP را معرفي کردند(34). SRAP، تکنيک نشانگر تقريبا جديدي است که توالي کددهنده ژنوم را توسط پرايمرهاي 17 تا 19 نوکلئوتيدي هدفگيري مي کند (40) که به خصوص براي تکثير توالي (Open Reading Frame) ORF مورد استفاده قرار ميگيرد و بر مبناي 2 پرايمر تکثيرکننده ميباشد (55) . اين سيستم نشانگر حتي قابليت تشخيص ميزان بالائي از پليمورفيسم را نيز در بين گونهها دارد (47).
مارکرهاي SRAP تمام ويژگيهاي يک مارکر مولکولي مناسب را از قبيل همبارز بودن دارد يعني مي تواند هوموزيگوتها را از هتروزيگوت ها تشخيص دهد (35). پرايمر forword داراي 17 جفت نوکلوئيد است که 14 نوکلوئيد آن ثابت و غني ازG,C است و3 نوکلئوتيد متغير آن در انتهاي /3 قرار دارد. اين پرايمر ترجيحا ناحيه اگزون را تقويت ميکند (ناحيه اگزون غني از G,C است). پرايمر Reverse داراي 19 جفت نوکلئوتيد است که 16 نوکلئوتيد آن ثابت و غني ازA,T است و3 نوکلئوتيد متغير آن در انتهاي /3 قرار دارد. اين پرايمر ترجيحا ناحيه اينترونها وپروموتورها را تقويت ميکند (35). پلي مورفيسم اساساً از تنوع طول اين اينترونها وپروموتورها و فاصلهها، ايجاد ميشود. 3 نوکلئوتيد متغير انتهايي SRAP ميتواند بر طبق طراحي ترکيبات مختلف پرايمري تغيير کنند. جفت پرايمرها ميتوانند با ترکيب پرايمر forword و reverse ترکيبات جديدي را ايجاد کنند که هزينه سنتز پرايمرها را کاهش ميدهد و استفاده از پرايمرهاي موثر را افزايش ميدهد (شکل1-4).
Ferriol و همکاران گزارش دادند نشانگر SRAPبيشترين هماهنگي را با تغييرات مورفولوژي نسبت به ساير نشانگرها دارد. زيرا SRAPباعث تکثير توالي ORFs(قالب خواندني باز) ميشود که در واقع اين توالي هدف در ارتباط مستقيم با بروز صفات مورفولوژيکي در موجودات ميباشند. Budakو همکاران (2004). چهار نشانگر درbuffalograss براساس قدرت تنوع ژنتيکي مقايسه کردند(71،36،43و35).
SRAP SSR ISSR RAPD
شکل 1-4 نحوه اتصال پرايمرهاي forwad و reverse به DNA الگو
مزاياي نشانگر SRAP:
سهولت و آساني
تکرارپذيري (قابليت تکثير) بالا
سرعت عملکرد مناسب
جداسازي آسان باندها براي تعيين توالي
شناسايي و تکثير نواحي هدف( نواحي ORFs)
داشتن پليمورفيسم بالا
معايب نشانگر SRAP:
همبارز نبودن
1-13 کاربرد مارکرهاي DNA :
1-توالييابي ژنوم: شايد مهمترين کاربرد مارکرها باشد. از آنجا که ژنوم يوکاريوتها خيلي بزرگ است براي توالييابي آن بايد ژنوم را به قطعات خيلي کوچک تقسيم کرد و هر قطعه را جداگانه توالييابي نمود. لذا بايد روي DNA نقاط معياري وجود داشته باشد تا بتوان براساس آنها نتايج حاصل از توالييابي قطعات را کنار هم چيد. اين معيارها ميتوانند همان مارکرها باشند.
2- Gene tagging: عبارتست از يافتن پيوستگي بين صفت موردنظر با يک مارکر، اين امر با بررسي تفرق همزمان(Cosegregation) صفت و مارکر تحقق مييابد.
3- Gene mapping: عبارتست از تعيين محل يک ژن روي کروموزوم.
4- بررسي روابط خويشاوندي: با استفاده از پليمورفيزم مارکري ميتوان افراد مختلف را از هم متمايز ساخت. اين مورد بيشتر در مطالعات فيلوژنتيکي و تعيين مبدا تنوع اهميت دارد.
5- تعيين گروههاي هتروتيک: در تهيه بذر هيبريد تعيين لاينهاي اينبرد والديني اهميت زيادي دارد. اين والدين بايد طوري انتخاب شوند که تعداد هتروزيس حداکثر باشد. مقدار هتروزيس به ميزان غالبيت در هر لوکوس و فاصله ژنتيکي والدين بستگي دارد. اين فاصله ژنتيکي را ميتوان از آناليز کلاستري که با استفاده از پليمورفيزم مارکري در بين لاينهاي مختلف به دست ميآيد، تعيين کرد و بهترين اينبردها را انتخاب نمود.
7-انتخاب به کمک مارکر (26MAS):مهمترين کاربرد مارکرها در اصلاح نباتات است. هدف اين است که بتوان صفت مورد نظر را با واسطه مارکر پيوسته با صفت، انتخاب کرد. اين مساله بسيار مهم است چرا که اگر پيوستگي يک مارکر با ژن موردنظر تاييد شود آنگاه ميتوان در هر مرحلهاي از رشد گياه و در هر محيطي اقدام به گزينش نمود. اغلب صفات مهم زراعي مثل عملکرد،
مقابله با خشکي و شوري و … صفاتي کمي هستند که توسط لوکوسهاي کمي (QTL27) کنترل ميشوند. لذا امروزه در پروژههاي اصلاحي سعي بر نقشهيابي QTLها است تا بتوان از آنها در MAS استفاده کرد.
7-حفظ ذخاير ژنتيکي: به کمک مارکرها ميتوان تنوع ژنتيکي موجود را بررسي کرد و در حفظ و سازماندهي آن اقدام نمود(12).
1-14 واکنش زنجيرهاي پليمراز (PCR)
اين تکنيک در اواسط دهه 1980 بوسيله کري موليس و همکاران معرفي شد (62). روشي است براي همانندسازي گزينشي و مکرر تواليهاي مشخصي از DNA. راهکاري است براي توليد نسخههاي بيشمار از يک توالي ويژه DNA، بدون اينکه به عمليات وقتگير کلون کردن نيازي داشته باشد. PCR از نظر اصول عملي تشابه زيادي به همانند سازي DNA دارد. براي انجام PCR هر ناحيه از هر مولکول DNA به شرطي که تواليهاي دوطرفه آن شناخته شده باشد قابل انتخاب است بدين دليل که بايستي دو اليگونوکلئوتيد کوتاه با مولکول DNA هيبريد گردند يعني هر کدام به يکي از رشتههاي مارپيچ دوتايي DNA متصل شود. اين اليگونوکلئوتيدها که به عنوان آغازگر28 براي سنتز DNA بکار ميروند ناحيهاي را که بايستي تکثير شود محدود مينمايند تا کپي شدن الگوي DNA توسط آنزيم پليمراز امکانپذير شود. براي تسهيل در اتصال آغازگر به DNA الگو، لازم است که اول رشتههاي DNA توسط حرارت از هم باز شوند، سپس دماي واکنش کاهش داده ميشود تا جفتشدن آغازگر با توالي موردنظر صورت پذيرد. در نهايت واکنش پليمريزاسيون توسط آنزيم DNA پليمراز براي توليد رشته مکمل انجام ميشود.
1-14-1 مراحل واکنش زنجيرهاي پليمراز
1- مرحله شروع29: به مدت ? تا ? دقيقه دماي محلول به ?? تا ?? درجه سانتيگراد رسانده ميشود (در صورتي که پليمرازها به حرارت بالا مقاوم باشند دما تا 98 درجه سانتيگراد نيز ميرسد). اين مرحله فقط براي DNA پليمرازهايي ضروري است که نيازمند فعال شدن توسط حرارت هستند.
2- مرحله واسرشت30: اين مرحله شامل تجزيه DNA از حالت دو رشتهاي به حالت تکرشتهاي است. در واقع اولين قسمت از سيکلهاي حرارتي منظم است و شامل حرارت دادن محلول به مدت ?? تا ?? ثانيه در دماي ?? تا ?? درجه ميباشد. در اين مرحله بهعلت گسستن پيوندهاي هيدروژني بين نوکلئوتيدها، DNA الگو و آغازگرها از هم جدا ميشوند و تکرشتههاي DNA حاصل ميگردند.
3- مرحله اتصال31: اين مرحله بسيار مهم است. دماي بهينه اتصال بستگي به نوع آغازگرهاي مورداستفاده دارد. دماي محلول به مدت ?? تا ?? ثانيه به ?? تا ?? درجه کاهش مييابد. در اين مرحله آغازگرها به تکرشتههاي DNA الگو متصل ميشوند. پيوندهاي هيدروژني پايدار تنها زماني شکل ميگيرد که توالي آغازگر و رشته الگو مکمل يکديگر باشند. آنزيم پليمراز پس از اتصال به هيبريد آغازگر- الگو، همانندسازي DNA را آغاز ميکند (69).
4- مرحله طويل شدن32: اين مرحله شامل بسط دادن دنباله آغازگر توسط آنزيم DNA پليمراز است. دماي محلول در اين مرحله بايد متناسب با نوع DNA پليمراز مورداستفاده باشد. براي انجام اين مرحله از يک DNA پليمراز ويژه به نام تک DNA پليمراز33 استفاده ميشود. دماي اپتيمم براي اين آنزيم حدود ?? الي ?? درجه است. در اين مرحله آنزيم DNA پليمراز با استفاده از dNTPهاي موجود در محلول، يک رشته DNA جديد را در جهت ‘? به ‘? و در مقابل رشتههاي الگو ميسازد. مدت زمان اين مرحله نيز بايد متناسب با نوع DNA پليمراز و طول رشته DNA باشد. در دماي بهينه، DNA پليمراز در هر دقيقه، يک هزار باز را پليمريزه مينمايد. در مرحله طويل شدن در صورت وجود سوبستراي کافي و تأمين شرايط بهينه، مقدار DNA در محلول PCR دو برابر ميشود. بنابر اين در هر چرخه PCR، غلظت DNA بصورت تصاعدي افزايش مييابد (روش PCR آنچنان سريع عمل ميکند که پس از گذشت 20 چرخه از آن، 1048576 نسخه از توالي موردنظر توليد خواهد شد). تعداد چرخهها معمولاً بين 25 تا 45 چرخه است و با افزايش اين تعداد، افزايش محصولات غيراختصاصي ديده ميشود. زمان هر چرخه بستگي به زمان لازم براي گرم شدن و خنک شدن بين چرخهها دارد.
?- مرحله طويل شدن نهايي34: اين مرحله، پس از آخرين چرخه PCR، به مدت ? الي ?? دقيقه در دماي ?? الي ?? درجه انجام ميشود تا اطمينان حاصل شود که همه تکرشتههاي DNA همانندسازي شدهاند .
نگهداري نهايي35: در اين مرحله، محلول نهايي به مدت کوتاهي در دماي ? الي ?? درجه قابل نگهداري است.
شکل 1-5 واکنش زنجيره اي پليمراز
1-15 تجزيه و تحليل دادهها
1-15-1 دندروگرام :
دندروگرام از دو واژه يوناني Dendron ، به معني درخت و gramma به معني کشيدن گرفته شده است و شامل يک نمودار درختي است که اغلب براي شرح و توضيح آرايش و نظم و ترتيب خوشهها به کار ميرودو به وسيله يک خوشهبندي مرتبهاي به وجود آمده است. دندروگرام اغلب در محاسبات بيولوژي براي شرح خوشهبندي اقلام بکار ميرود. دندروگرام يک اصطلاح گسترده براي نمايش يک درخت تکامل نژادي است. آناليز خوشهاي شامل چندين تکنيک متوالي است که براي تشخيص گروههائي از جنسهاي مشابه درون يک گروه خاص کاربرد دارد. در واقع آناليز خوشهاي، اطلاعات کلي ما را در چندين گروه مجزا تقسيم ميکند . روش خوشهبندي مرتبهاي توان ردهبندي انواع متفاوتي از اقلام را از اقلام بسيار مشابه با يکديگر تا خوشههاي بزرگي که شامل اقلام بسيار ناهمسان هستند را داراست. اين روش تجزيه و تحليلي معمولا يک محصول گرافيکي توليد ميکند که دندروگرام يا درختواره ناميده ميشود که در واقع همان ساختار خوشهاي مرتبهبندي شده را نشان ميدهد. بعضي از اين روشهاي ردهبندي

منابع و ماخذ پایان نامه نشانگرهاي، مبتني، روش‌هاي

د كه موجب مي‌شود ارزيابي تنوع تحت تأثير محيط باشد. با بررسي مجموعههاي ژنتيکي با استفاده از نشانگرهاي مولکولي مبتني بر DNA، تفاوتهاي ژنتيکي بيشتري مشاهده شده، اين تفاوتها تحت تأثير محيط و اثراتي مانند پليوتروپي، اپيستازي و دوره رشدي گياه نخواهند بود و امکان آگاهي دقيق و کافي از تنوع ژنتيکي در سطح DNA را فراهم ميسازند. با توجه به اهميت روزافزون توليد واريتههاي برتر و نياز به شناسايي و استفاده از آللها و ژنهايي که صفات مطلوبي را کنترل مينمايند، استفاده از نشانگرهاي DNA روزافزون خواهد بود.
1-12 انواع نشانگرها:
مارکرها انواع مختلفي دارند. در يک تقسيمبندي کلي ميتوان مارکرها را به صورت زير دستهبندي کرد:
1- مارکرهاي مورفولوژيکي يا فنوتيپي
2- مارکرهاي مولکولي
مارکرهاي مولکولي خود به دو دسته تقسيم ميشوند:
1- مارکرهاي بيوشيميايي
2- مارکرهاي DNA
1-12-1 نشانگرهاي مورفولوژيکي
مارکرهاي مورفولوژيکي همانگونه که از نام آنها مشخص است از روي فنوتيپ ارزيابي ميشوند و لذا ارزيابي آنها خيلي ساده است. تعداد اين مارکرها کم است و پليمورفيزم کمي نيز توليد ميکنند. از طرفي در اغلب موارد مارکر فنوتيپي در واقع يک صفت نامطلوب است، مثلا کوتولگي بوته، ابلق بودن برگ ها و … . لذا امروزه از اين نوع مارکرها استفاده نميشود. نشانگرهاي مورفولوژيکي اولين نشانگرهايي بودند که براي ارزيابي تنوع ژنتيکي مورد استفاده قرار گرفتند (20). نشانگرهاي مورفولوژيك كه پيامد جهشهاي قابل رويت در مورفولوژي هستند، شامل دامنه وسيعي از ژن‌هاي كنترلكننده صفات مورفولوژيك ميشوند كه بر ظاهر يا فنوتيپ موجود مبتني بوده و جزو نخستين نشانگرها به شمار ميآيند كه از زمانهاي بسيار دور، يعني زماني كه هنوز محل ژن روي كروموزوم مشخص نشده بود، مورد استفاده قرار ميگرفتند. دلايل عمده محدوديت استفاده از نشانگرهاي مورفولوژيکي عبارتند از: تعداد اين نشانگرها کم بوده، وابسته به سن و مرحله رشدي گياه هستند و غالباً از شرايط محيطي تأثير ميپذيرند و درضمن اساس ژنتيکي بسياري از آنها هنوز مشخص نشده است. در صورتي که هنوز بررسي تنوع ژنتيكي بر اساس صفات مورفولوژيک يک گام اوليه در جهت توصيف و گروهبندي ژرمپلاسمها است (57).
1-12-2 نشانگرهاي بيوشيميايي
نشانگرهاي بيوشيميايي شامل موارد متعددي است. اين نوع مارکرها نيز امروزه کارايي زيادي ندارند چرا که تعداد آنها کم بوده و پليمورفيزم کافي ايجاد نميکنند، ليکن نکته مثبت در آنها همبارز بودن است.
اين گروه را ميتوان به دستههاي زير تقسيم کرد:
الف. مولکولهاي بيوشيميايي کوچک: مثل ترکيبات فنلي، ترکيبات معطر و …
ب. پروتئينهاي ذخيرهاي: مثل گلوتنين و گليادين که در گندم خصوصا در تعيين ارزش نانوايي کاربرد دارد.
ج. آيزوزايمها: اينها در واقع فرمهاي مختلف يک آنزيم هستند که يک واکنش را کاتاليز ميکنند ولي ممکن است سرعت فعاليت آنها متفاوت باشد. اين مارکرها در دهه 80 کاربرد زيادي داشتند. تنکسلي توانست بر اساس آيزوزايمها در گوجه فرنگي اولين نقشه لينکاژي را طراحي نمايد. و معايب آيزوزايم‌ها عبارتند از: تنها تعداد محدودي آيزوزايم براي هر گونه وجود دارد، تعداد سيستم‌هاي آنزيمي چند شکل و قابل دسترس محدود است و مكان‌هاي آنزيمي فقط شامل قسمت محدود و غيرتصادفي از ژنوم هستند (قسمت بيانشونده). بنابراين تنوع مشاهده شده ممكن است بيانگر كل ژنوم نباشد. اگرچه با اين روش مي‌توان تعداد زيادي از نمونه‌ها را بررسي کرد ولي مقايسة نمونه‌ها از گونه‌هاي مختلف، مكان‌هاي ژني و آزمايشگاه‌هاي مختلف مشكل ساز است. بطوريكه اين روش تحت تأثير روش‌هاي استخراج، بافت گياه و مرحلة رشد گياه قرار مي‌گيرد(62و42).
د. آللوزايم‌ها آلل‌هاي متفاوت آنزيم‌ها هستند كه يك ارزيابي از فراواني ژني و ژنوتيپي در درون و بين جمعيت‌ها ارائه مي‌دهند که اين اطلاعات مي‌توانند جهت گروه‌بندي جمعيت‌ها، تنوع ژنتيكي، جريان ژن، ساختار ژنتيكي گونهها، مقايسة ميزان تلاقي‌هاي بين‌گونه‌اي، ساختار جمعيت و واگرايي جمعيت‌ها استفاده شوند (42).
مزيتهاي مهم اين‌گونه نشانگرها عبارتند از: ارزيابي به صورت هم‌بارز و بدون دخالت تأثيرات اپيستازي و پليوتروپي، كاربرد آسان و هزينة پائين.
1-12-3 نشانگرهاي مولكولي مبتني بر DNA
مارکرهاي DNA در واقع مهمترين و کاربرديترين سيستمهاي مارکري هستند که گستردگي زيادي داشته و هرروزه در حال توسعه و تکامل هستند. از آنجا که در اولين سطح بيان ژن مطرح ميشوند، خيلي دقيق بوده، داراي تنوع زياد و پليمورفيزم بالا هستند.
نشانگرهاي مولكولي بر اساس آشكارسازي تفاوت‌ (چندشکلي10) موجود در بين اسيدهاي نوكلئيك افراد مختلف عمل مي‌كنند. اين تفاوت‌ها شامل پديده‌هاي حذف، اضافه، جابجايي، دو برابر شدن و جهش‌هاي نقطه‌اي است و تنها ژن‌هاي خاص و فعال را شامل نمي‌شود. نشانگرهاي مولكولي علاوه بر اينكه تحت تأثير محيط نيستند داراي مزيت‌هاي زير ميباشند:
1- تمام قسمت‌هاي ژنوم را پوشش مي‌دهند (اگزون‌ها، اينترون‌ها و نواحي تنظيمكننده).
2- تحت تأثير پليوتروپي و اپيستازي قرار نمي‌گيرند.
3- قادر به شناسايي تفاوت‌هايي هستند كه تنوع فنوتيپي نشان نمي‌دهند.
4- بعضي از آنها هم‌بارز هستند.
روش‌هاي مختلف مورد استفاده شامل: هضم و هيبريداسيون اسيدهاي نوکلئيک، روشهاي مبتني بر واكنش‌هاي زنجيره‌اي پليمراز (11PCR) و يا تركيبي از دو روش ذكرشده هستند. بعلاوه روش‌هاي مختلف نشانگري مي‌توانند يك مكان يا چند مكان ژنومي را مورد بررسي قرار ‌دهند. بطوريکه نشانگرهاي چند مکاني12 قادرند بطور همزمان چندين مکان ژنومي را مورد بررسي قرار دهند. اين نشانگرها مبتني بر تكثير تصادفي DNA بواسطة آغازگرهاي اليگونوكلئوتيدي با توالي‌هاي انتخابي هستند، اين گونه نشانگرها را نشانگر‌هاي غالب نيز مي‌نامند. بنابراين امكان تشخيص حضور يا عدم حضور باند براي هر مکان وجود دارد ولي امكان تشخيص حالت‌هاي هتروزيگوت (A/-) يا هموزيگوت (a/a) براي آلل‌هاي مشابه وجود ندارد. در حاليكه نشانگرهاي يك مكاني13 از كاوشگرها يا آغازگرهاي ويژه براي مكان‌هاي ژني استفاده مي‌كنند و قادر به تكثير يا دورگگيري DNA با توالي‌هاي شناختهشده هستند. اين نشانگرها را نشانگرهاي هم‌بارز نيز مي‌نامند كه امكان تشخيص مكان‌هاي هموزيگوت و هتروزيگوت را به ما مي‌دهند(42).
روش‌هاي نشانگري پايه را مي‌توان به 2 دسته تقسيم كرد:
1-روش‌هاي غير مبتني بر PCR يا روش‌هاي مبتني بر هيبريداسيون.
2-روش‌هاي مبتني بر PCR
1-12-3-1 روش‌هاي غير مبتني بر PCR
روشهاي مولكولي مبتني بر هيبريداسيون از اولين نشانگرهايي هستند که در مطالعات گياهي مورداستفاده قرار گرفتند. اين نشانگرها شامل استفاده از آنزيم‌هاي برشي و روش‌هاي دورگگيري بودند (59). آندونوكلئارهاي هضمكننده، آنزيم‌هاي باكتريايي هستند كه قادر به شناسايي توالي‌ پاليندرم ويژه و برش DNA هستند كه اين برش سبب ايجاد قطعاتي با اندازه‌هاي مختلف مي‌شود. تغييرات درون توالي (مثل جهش نقطه‌اي)، جهشهاي بين مكاني (مثل حذف و جابجايي) و جهشهاي درون مكان آنزيمي مي‌توانند منجر به تفاوت طول قطعات بعد از برش آنزيمي شوند. نشانگرهاي RFLP14 و تعداد متفاوت رديف‌هاي تكراري (15VNTR)، نمونه‌هايي از نشانگرهاي مبتني بر هضم و هيبريداسيون هستند. در RFLP چندشكلي DNA بوسيلة هيبريداسيون كاوشگر (كه به روش شيميايي نشاندار شده است) با قطعاتDNA انتقال سادرنيافته انجام مي‌گيرد كه سبب ايجاد پروفايلهايي از قطعات DNA ميشود. نشانگر RFLP داراي چندشكلي نسبتاً زيادي است، توارث همبارز داشته و تكرارپذيري بالايي نشان مي‌دهد. در اين روش لكه‌هاي DNA حاصل از دورگ گيري را مي‌توان پاك كرد و قطعات انتقال سادرنيافته را دوباره با کاوشگرهاي 16‌ RFLP جديد (8 تا 10 مرتبه) مورد بررسي قرار داد. با اين وجود، اين روش‌ها به علت وقت‌گير بودن، داشتن مواد راديواكتيويتهي گرانقيمت و سمي و نياز به DNA با كيفيت و كميت بالا به طور وسيع مورداستفاده واقع نمي‌شوند. بعلاوه اين نشانگرها به اطلاعات اوليه از توالي DNA‌ جهت ساختن كاوشگر نياز دارند كه سبب پيچيدگي روش مي‌شود. اين محدوديت‌ها سبب شده است كه روش‌هاي با پيچيدگي كمتر مانند نشانگرهاي مبتني بر PCR توسعه يابند (42). بازرترين نوع اين مارکرها، RFLP ميباشد. VNTRها و ميکروستلايتها نيز در اين گروه قرار دارند. در اين نوع مارکرها يک قطعه DNA نشاندار شده (پروب) جهت هيبريداسيون استفاده ميشود. RFLP در سال 1980 توسط Botstain ابداع شد و دقت بسيار زيادي دارد، ليکن امروزه صرفا به دليل وقتگير و پرزحمت بودن آن، کمتر استفاده ميشود.
1-12-3-2 نشانگرهاي مبتني بر PCR
اين نشانگرها كه كاربرد آنها سير صعودي دارد، توسط موليس و همكارانش (1986) توسعه پيدا كرده و از واكنش‌هاي زنجيره‌اي پلي‌مراز (PCR) پيروي مي‌كنند. اين تكنيك شامل تكثير چندين قطعه DNA مجزا است كه توالي‌هاي اطراف آنها بسيار مشابه آغازگر مي‌باشد، اين نواحي بايد به قدر كافي به همديگر نزديك باشند تا تكثير انجام گيرد. استفاده از آغازگرهاي تصادفي محدوديت داشتن اطلاعات اوليه براي انجام PCR را ندارد. روش‌هاي مبتني بر PCR را مي‌توان به دو گروه: 1- روش‌هاي مبتني بر PCR تواليهاي غير ويژه. 2- روشهاي مبتني برPCR توالي‌هاي هدف17 تقسيم كرد. در اين قسمت تعدادي از نشانگرهاي مبتني بر PCR توضيح داده ميشود (42).
1-12-3-2-1 نشانگرRAPD18:
نشانگر RAPD، نخستين نشانگر مولکولي مبتني بر واکنش زنجيره پليمراز بود که براي بررسي تنوع ژنتيکي مورداستفاده قرار گرفت. ماركرهاي RAPD از طريق تكثير تصادفي DNA ژنومي و با استفاده از آغازگرهاي كوتاه ايجاد ميشوند. تفکيک قطعات حاصل بر روي ژل آگارز در حضور اتيديوم برومايد صورت ميگيرد، و در نهايت، زير نور ماوراء بنفش مشاهده ميگردد. اگرچه آغازگرها داراي تواليهاي تصادفي هستند، قادر به يافتن تواليهاي هومولوگ مناسب روي رشته DNA ميباشند. چندشكليهاي DNA بدليل نوآرايي يا حذف در محل اتصال آغازگرها يا ناحيه قابل تکثير ايجاد ميشوند (68).
1-12-3-2-2 نشانگر19AFLP:
براي غلبه بر محدوديت تکرارپذيري RAPD، تکنولوژي AFLP توسط شرکت هلندي کيجن20 توسعه پيدا کرد (68). نشانگر AFLP توسط هضم DNA با دو يا چند آنزيم برشي، اتصال آداپتور به دو انتهاي قطعات، PCR با آغازگرهاي اختصاصي و جداسازي قطعههاي حاصل روي ژل پلي اکريل اميد صورت ميگيرد (12). با توجه به نتايج بدستآمده از آن تکنيک مقرون به صرفه و داراي تکرارپذيري، ثبات و قابليت اطمينان بيشتري نسبت به مارکر RAPD ميباشد به همين دليل بطور وسيعي در تهيه نقشه کروموزومي گياهان مورداستفاده قرار گرفته است. در استفاده از اين مارکر بايد مراحل انجام کار با دقت و کيفيت بالا صورت گيرد (65).
1-12-3-2-3 نشانگر21SSR:
مورگانت و اوليويري در سال 1993 براي اولين بار ريزماهوارهها را در توالي گياهان گزارش کردند. ريز ماهوارهها يا رديف هاي تکراري ساده (SSR) شامل واحدهاي نوکلئوتيدي تکي تا شش تايي تکرار شونده هستند که در ژنوم بيشتر يوکاريوتها پراکندهاند (26). معمولاً تکرارهاي 1 تا 4 نوکلئوتيدي در ژنوم يوکاريوتها بيشتر يافت ميشوند. ريزماهوارهها به صورت طبيعي در نواحي غير کدکننده DNA از قبيل اينترونها و تـواليهاي بين ژني ديده ميشوند. ريـز مـاهوارهها معمولاً نـزديک بـه SINEs22 و LINEs23 ها و نزديک به عناصر شبه رتروترانسپوزونها ديده ميشوند (25). ريزماهوارهها به نواحي کدکننده ژنوم نيز متصل
شدهاند (18). ريزماهوارهها در نقشهيابي ژنومي، انگشتنگاري DNA، سازماندهي ژرمپلاسم و مطالعات سيتوژنتيکي و ارزيابي تنوع ژنتيکي

منابع و ماخذ پایان نامه استان فارس، احساس درد

خاکستري شونده، جوانهها تخممرغي به طول 2 تا 5 ميليمتر با فلسهاي درشت، کرکدار. برگها در زمستان ريزان، در روي سطح فوقاني با کرکهاي ستارهاي تنک، سطح تحتاني با کرکهاي ستارهاي زرد يا خاکستريشونده گاهي مخلوط با کرکهاي غدهدار پتويي؛ پهنک به طول 6-10 (15-) و عرض 4-7 (9-) سانتيمتر، تخممرغي يا مستطيلي تخم مرغي، با قاعده قلبي، دندانههاي 7 تا 14 تايي کوتاه با نوکي به طول 1-2 ميليمتر؛ رگبرگهاي فرعي 8-16 جفت، موازي، تا ميان دندانهها ممتد (در ميان دندانهها نفوذ مي کند)؛ رگبرگهاي بينابيني (فرعيتر) وجود ندارد؛ دمبرگ به طول 1-2 سانتيمتر. گل آذين دمگربهاي نر به طول 4-6 سانتيمتر، با محور کرکدار؛ گلپوشهاي نر با بريدگيهاي پهن 4-6 تايي کمعمق (هيچگاه بريدگيها عميق نيستند)، بريدگيها به نيمه گلپوش نميرسند؛ پرچمها 5-7 تايي. گلهاي ماده منفرد يا دوتايي، با محوري به طول 15 سانتيمتر. پياله نيمهکروي يا مخروطي که 20 تا 50 درصد ميوه را در بر ميگيرد، به ارتفاع 2-3 سانتيمتر وقطر 4 سانتيمتر، با فلسهاي درشت، کرکدار، به صورت افقي گسترده. ميوه بلوط به طول تا 5 سانتيمتر، با زخم محدب. اين گونه اغلب گال ايجاد ميکند(11).
-4 پراکندگي جهاني اين جنس
اين جنس بومي نيمکره شمالي (اروپا، افريقا، آمريکاي شمالي و آسيا مخصوصا در جزاير پلينزي در اقيانوس آرام) است (14) و از نواحي قطبي تا نواحي نيمهخشک پراکنده شدهاست (16). مکزيک يکي از مراکز تنوع جنس بلوط است که داراي 135 تا 150 گونه شامل 86 گونه اندميک ميباشد (61)(شکل1-1).
شکل1- 1 پراکندگي جهاني جنس بلوط (Quercus)
1-5 پراکندگي اين جنس در ايران
در ايران نيز چند گونه بلوط در جنگلهاي شمال و غرب ايران انتشار دارند Q. macranthera با نام محلي اوري و Q.castanefolio با نام محلي مازو از مهمترين جنگلهاي شمال و ارسباران هستند (5). جنگلهاي زاگرس که جنگلهاي بلوط غرب نيز ناميده مي شود با طول تقريبي 1300 کيلومتر در امتداد رشتهکوه زاگرس از جنوب آذربايجان غربي تا استان فارس ادامه دارند (21 و 14). درخت بلوط از بارزترين گياهان درختي به شمار ميرود (21). زاگرس جنوبي رويشگاه خالص گونه Q.brantii Lindl. يا بلوط ايراني ميباشد(شکل1-2).
شکل 1- 2 پراکندگي جنس بلوط(Quercus) در ايران
1-6 شرايط اکولوژيکي
درخت بلوط در خاک پررس مرطوب رشد ميکند ولي خاکهاي شني را نيز تحمل ميکند. اين درخت در مناطق جنگلي و پست يافت ميشود. جنگلهاي بلوط به دوره کوتاه خشکي در تابستان و باران زياد در بهار نياز دارند (2).
1-7 ترکيبات شيميايي بلوط
در پوست و برگ درختان بلوط تاننهايي وجود دارد که از نظر ترکيب شيميايي مشابهت نزديک با يکديگر دارند. پوست شاخههاي جوان برخي گونههاي دارويي داراي 10 تا 20 درصد (در شاخههاي مسن 0 تا 10 درصد) از نوعي تانن فيزيولوژيکي يعني اسيد کوئرسيتانيک1 محلول در آب، نوعي قند محلول در آب به نام کوئرسيت2، 6/1 درصد اسيد گاليک، اسيد ماليک، يک ماده تلخ به نام کوئرسين3 ، فلوروگلوسين، موسيلاژ، مواد پکتيکي، مواد رزيني، اکسالات کلسيم و نوعي ماده رنگي قرمز به نام قرمز بلوط و به مقدار کم از کولاکاتشين4 و غيره است. ميوه داراي 5 درصد ماده روغني، 65/6 درصد پروتئين، 7 درصد از قندهاي مختلف، 3/44 درصد آميدون، 2/3 درصد پنتوزان، مقدار کمي کوئرسيت و معادل 7 درصد از نوعي تانن است. در گال که بر روي برگ و جوانههاي بلوط تحت اثر گزش حشرات مخصوص از دسته نيمبالان، ايجاد ميشود نوعي تانن به نام اسيد گالوتانيک5 يافت ميشود که سابقا آن را انيدريدي از اسيد گاليک تصور مينمودند و در نتيجه آن را اسيدديگاليک6 نوعي گلوکوزيد تصور ميکردند (4).
1-8 اهميت درماني بلوط
اهميت درماني درختان بلوط بيشتر مربوط به تانني است که در اندامهاي آن فراهم ميشود. اين ماده را بايد يکي از شاخصترين موادي دانست که در عالم گياهان توليد ميشود. اين ماده مهم گياهي خواص مختلفي نظير رسوب دادن آلبومين، به وجود آوردن پوشش محافظ براي بافتها، جلوگيري کردن از عفونيشدن و غيره را داراست. طبق بررسيهايي که به عمل آمده است فراوردههاي تانن تاثير مثبتي در درمان سل، التيام زخمها و جلوگيري از ترشحات مخاط دارند. اعضاي مختلف درختان بلوط به علت دارا بودن تانن اثر قابض، بند آوردن خون و تقويتکننده عمل بعضي از اعضاي بدن را دارند. برگ بلوط در بيماريهاي مختلف مانند اختلاط خوني، خونرويهاي مختلف، زخم معده، آغاز بيماري سل، ديسانتري، بياختياري دفع ادرار در اطفال، رفع ترشحات زنانگي و بواسير اثر قاطع دارد. در استعمال خارجي، جوشاندههاي غليظ آن به صورت غرغره در معالجه ورم حنجره و لوزه مؤثر واقع ميشود.
پوست درخت بلوط (Q. robur) پادزهر خوبي در مسموميتهاي ناشي از آلکالوئيدها است و اثر غيرقابلانکاري در رفع خونرويها، اختلاط خوني، سل، نرمي استخوان و غيره دارد (پوست گونههاي ديگر به علت دارا بودن تانن فراوانتر کمتر در مصارف داخلي بکار ميروند). بايد توجه داشت مصرف زياد يا طولاني مدت آن باعث خستگي عضلات معده، احساس درد عضله قلب و تحريک دستگاه هضم ميشود. ارزش درماني پوست بلوط در استعمال خارج، بيشتر از مصارف داخلي آن است مانند آن که استعمال جوشاندههاي گرد پوست بلوط، به صورت حمامهاي موضعي، لوسيون، غرغره، تنقيه و شستشو به صورتهاي مختلف، جهت درمان بيماريها در موارد اولسرهاي سرطاني، التهاب غدد به علت انسداد مجاري آنها، خونمردگي سوداء، بيماريهاي مزمن پوستي ديگر، اگزما، واريس، خيز عمومي بدن و غيره ميتوان استفاده کرد. از لوسين موجود در پوست درخت بلوط، در موارد انسداد مجاري لنفاوي، دررفتگي اعضا، جمع شدن آب در مفاصل، سرمازدگي، اولسرهاي عفوني و اولسرهاي قانقاريايي چرکين نيز استفاده ميشدهاست، به علاوه آن را در موارد بروز ترشحات مهبلي و سوزاکهاي مزمن و غيره هم بکار ميبردهاند.
ميوه بلوط جهت رفع اسهال و درمان ديسانتري، سوءهاضمه، درد معده، نزلههاي مزمن، کمخوني، نرمي استخوان، سياهسرفه، درمان سل در مراحل اوليه، سستي و ضعف استخوانها و غيره به کار ميرود. مخلوط آرد ميوه بلوط بوداده با کاکائو، بهترين دارو جهت رفع اسهالهاي ساده اطفال است.
گالها به عنوان مقوي معده، قابض و رفعکننده خونرويها به کار ميروند (4).
1-9 مصرف خوراکي بلوط
ميوه فندقه درختان بلوط که عموماً در پيالهاي جاي دارد و آکورن ناميده مي شود، از قديم مورد استفاده مردم دنيا بودهاست. طعم آن در بعضي گونهها مانند Q. ballota Desf مخصوصاً نژادي از آن که در الجزيره و اسپانيا ميرويد بسيار مطبوع است. بعضي از گونههاي آمريکا و برخي از انواع موجود در ايران نيز ميوههاي خوراکي دارد و از آنها براي تغذيه استفاده ميشود. از مخلوط آرد ميوه درشت بلوط با آرد گندم، در بعضي نواحي نان تهيه ميشود. در دورانهاي قبل ميوه بلوط را بو ميدادند تا تانن آن با اين عمل کاهش يابد سپس از آن در تهيه نوعي قهوه استفاده ميکردند، اين قهوه داراي دکسترين به جاي آميدون ميوه است (4). ميوه بلوط هم به صورت مستقيم مورد تغذيه دام و وحوش قرار ميگيرد و هم جمعآوري شده و به عنوان علوفه زمستاني مورد تغذيه دام قرار ميگيرد (2).
1-10 اهميت اقتصادي بلوط
درخت بلوط از مهمترين درختان جنگلي ايران محسوب ميشود. چوب آن داراي مصارف صنعتي است. چوب بلوط داراي چگالي g/cm375/0 بوده و استحکام و سختي زيادي دارد و نسبت به حشرات و حمله قارچها بسيار مقاوم است و بافت بسيار جالبي دارد. پوست و گالهاي درخت بلوط هم سرشار از تانن هستند و در صنعت چرمسازي و رنگسازي مورداستفاده قرار ميگيرد (5).
شکل 1-3 نمايي از گونه Quercus brantii Lindl.
1-11 تنوع ژنتيکي :
تنوع ژنتيکي به تنوع ژني درون گونهها اطلاق ميشود. به عبارتي تنوع ژنتيکي، تنوع قابل توارث درون و بين جمعيتهاست. کليه تنوعهاي موجود با توالي چهار جفت باز تشکيلدهنده مولکول DNA، اجزا سازنده کدهاي ژنتيکي مرتبط ميباشند. انواع ديگري از تنوع ژنتيکي را نيز ميتوان در کليه سطوح سازماندهي شده در هسته شامل مقدار DNA، تعداد کروموزم و ساختار DNA شناسايي کرد. تنوع و تکامل ژنتيکي در جمعيتهاي گياهي ميتواند بوسيله جهش، نوترکيبي، مهاجرت، رانده شدن ژنتيکي و گزينش ژنتيکي ايجاد شده باشد (64). کسب اطلاع از فاصله ژنتيکي در بين افراد يا جمعيتها و آگاهي از روابط خويشاوندي گونههاي موردنظر در برنامههاي اصلاحي، امکان سازماندهي ژرمپلاسم و نمونهگيري مؤثر از ژنوتيپها را فراهم ميسازد (1). قدم اول در اصلاح خصوصيات گياهي، فهم از ساختار کلکسيون ژرمپلاسم است که اين موضوع به نوبه خود نمونهگيري سيستماتيک ژرمپلاسم را براي مقاصد اصلاحي و حفاظتي امکانپذير ميسازد. براي بهرهبرداري از منابع ژنتيکي با حداکثر کارآيي، شناخت مواد ژنتيکي نگهداري شده ضرورت دارد. ارزيابي نمونهها ميتواند با توجه به هدف استفاده از ژرمپلاسم صورت گيرد که جنبههاي اگرونوميکي، پاتولوژيکي، مورفولوژيکي، سيتولوژيکي، بيوشيميايي و مولکولي از جمله اين اهداف است. در راستاي اين ارزيابي نقاط قوت و ضعف تودهها و ژنوتيپها و پتانسيلهاي موجود در آنها شناخته ميشود. به عبارت ديگر در اين ارزيابيها وسعت پايه ژنتيکي هر صفت معلوم ميگردد (12 ،7 و6) تنوع ژنتيکي يک صفت معين، اندازه پراکنش ارزشهاي همان صفت است، به طوري که تأثير محيط بر آن زدوده شده باشد. تنوع بين گياهان يک گونه گياهي خاص بر دو نوع است: تنوع بر اثر محيط، که به مقادير مختلف تنش محيطي واکنش ميدهد و با مقايس? گياهان دو جمعيتي که از لحاظ ژنتيکي يکنواخت هستند، ميتوان آنرا مشاهده نمود. تأثير محيط روي يک گياه، به نتاج آن منتقل نميشود و بنابراين انتخاب در يک جامعه يکنواخت ژنتيکي، به جدا نمودن نژادهايي که در واکنش به تنشهاي محيطي اختلاف دارند، نميانجامد. تنوع ارثي به تنوع موجود در يک جمعيت مخلوط ژنتيکي، که از عوامل ارثي ناشي شده و به نتاج انتقال مييابد، اطلاق ميگردد .از آنجايي که اين نوع تنوع، ناشي از عوامل ارثي است و به نتاج قابليت انتقال دارد، لذا در اصلاح نباتات و برنامههاي اصلاحي حائز اهميت است، منشأ تنوع ارثي در گياهان، نوترکيبيهاي ژنتيکي، تغييرات درکروموزومها و جهشها است (7).
1-11-1 اهميت تنوع ژنتيکي و روشهاي مختلف ارزيابي آن
شناخت کيفي و کمي تنوع ژنتيکي از اهميت زيادي در علوم بيولوژي مانند اکولوژي، بيولوژي تکامل، تاکسونومي يا ردهبندي، ژنتيک و اصلاح نباتات برخوردار است. اهميت تنوع ژنتيکي به خوبي براي همه روشن بوده و نشان داده شده است که کاهش تنوع ژنتيکي ميتواند منجر به کاهش شايستگي و سازگاري به تغييرات محيطي گردد. ارزيابي تنوع ژنتيكي معمولاً در سطح مولكولي و با استفاده از چندين روش آزمايشگاهي انجام مي‌گيرد كه از آن ميان مي‌توان به آللوزايمها7 ، آناليز DNA8 و ايزوزيم9ها اشاره كرد كه قادرند ارزيابي دقيقي از تنوع ژنتيكي را فراهم نمايند. ارزيابي ترکيب ژنتيکي گياهان زراعي و مجموعههاي ژنتيکي و قرابت بين آنها از گذشتههاي دور معمول بوده است، بطور تاريخي اين تخمين براساس بيولوژي اندامهاي جنسي، دادههاي اکوجغرافيايي، زيستشناسي، رنگيزهها و شجرهنامه و اخيراً با استفاده از نشانگرهاي پروتئيني مانند ايزوزايم صورت ميگرفته است همچنين تنوع ژنتيكي ممكن است با استفاده از صفات مورفولوژيكي نيز مورد ارزيابي قرار گيرد. بررسي صفات مورفولوژيكي به تكنولوژي گراني نياز ندارد ولي اغلب، اين فعاليتها به زمين وسيعي نياز دارند که اين امر مي‌تواند سبب شود كه اين روش نسبت به روش‌هاي مولكولي هزينه بيشتري داشته باشد. بعلاوه اين صفات اغلب تحت تأثير نوسانات محيطي قرار مي‌گيرن

منابع و ماخذ پایان نامه ژنتيکي، داراي، جمعيتها

1-14-1- مراحل واکنش زنجيرهاي پليمراز 22
تجزيه و تحليل دادهها 24
1-15-1 دندروگرام 24
1-15-2 تجزيه خوشه اي 25
1-15-3 ضريب شباهت 26
1-15-4 انتخاب الگوريتم 26
بررسي كارآيي الگوريتم مورد استفاده در تجزيه كلاستر 26
شاخص شانون 27
بررسي تنوع و تفاوت ژنتيکي بين جمعيتها براساس آناليز Nei 27
سابقه تحقيق 28
1-15-1- مروري بر برخي پژوهشهاي انجام شده بر روي Quercus brantii Lindl. 28
1-15-2- مروري بر برخي پژوهشهاي انجام شده با استفاده از نشانگرSRAP 28
فصل دوم: مواد و روشها
2-1- انتخاب مناطق و جمعيتها 33
2-2- جمعآوري نمونه ها و آماده سازي آنها 34
2-3- استخراج DNA از نمونه هاي گياهي 34
2-3-1- آماده کردن نمونه ها 34
2-3-2- استخراج DNA 35
2-3-2-1- مواد موردنياز 35
2-3-2-2- روش کار 36
2-4- تعيين كيفيت وكميت DNA 37
2-5- واكنش زنجيره اي پليمراز) (PCR 39
2-6- الکتروفورز 41
2-6-1- محلول اتيديوم برومايد 42
2-6-2- تهيه ژل الکتروفورز 43
2-6-3- الکتروفورز محصول PCR 43
2-7- تجزيه و تحليل داده ها 44
فصل سوم: نتايج و بحث
3-1پليمورفيسم 46
3-2 بررسي پارامترهاي اصلي تنوع ژنتيکي همه لوکوسها در جمعيتهاي گونهQuercus brantii Lindl. 50
3-3 بررسي تنوع و تفاوت ژنتيکي بين جمعيتها براساس آناليز Nei 52
3-4 شباهت و فاصله ژنتيکي بين 5 جمعيت 54
3-5 بحث و نتيجهگيري کلي 55
3-6 پيشنهادات 59
منابع 62
فهرست شکلها
شکل1- 1 پراکندگي جهاني جنس بلوط (Quercus) 6
شکل 1-2 پراکندگي جنس بلوط(Quercus) در ايران 7
شکل 1-3 نمايي از گونه Quercus brantii Lindl. 10
شکل 1-4 نحوه اتصال پرايمرهاي forward و reverse به DNA الگو 20
شکل 1-5 واکنش زنجيرهاي پليمراز 24
شکل2- 1 جمعيتها و مناطق بررسي شده در اين تحقيق 33
شکل2-2 نمونههاي برگ تازه در آزمايشگاه 34
شکل 2-3 دستگاه اسپکتروفتومتر براي تعيين کميت DNA 38
شکل 2-4 دستگاه ترموسايکلر 41
شکل 2-5 دستگاه الکتروفورز عمودي 42
شکل 2-6 ساختار اتيديوم برمايد 42
شکل 2-7 دستگاه ژل داک 43
شکل 3-1 الگوي باندي پرايمر 46
شکل 3-2 دندروگرام ژنوتيپ هاي مورد بررسي 55
فهرست جداول:
جدول 2-1 اسامي جمعيتها و مناطق بررسي شده در اين تحقيق 33
جدول 2-2 مواد استفاده شده در PCR 39
جدول 2-3 برنامهPCR 40
جدول 2-4 پرايمرهاي مورداستفاده در آزمايش 40
جدول 3-1 نتايج کدگذاري آغازگر Me2-Em2 براي همهي جمعيتها 47
جدول 3-2 نتايج چندشکلي پرايمرهاي استفاده شده در اين تحقيق 49
جدول 3-3 پارامترهاي تنوع ژنتيکي همه لوکوسها در کل نمونهها بر اساس مارکر SRAP 51
جدول 3-4 شاخصهاي تنوع بين جمعيتي HT، HS، GST و Nem در جمعيتهاي Q. brantii 53
جدول 3-5 جدول ماتريس تشابه بدست آمده براي نشانگر SRAP در بين جمعيتها 54
چکيده
بلوط (Quercus) يکي از مهمترين جنسهاي چوبي نيمکره شمالي است. اين جنس از اصليترين گونههاي درختي ايران به شمار ميرود. تاکسونومي و ارتباط تکاملي جمعيتهاي بلوط ايراني بر اساس مارکرهاي مولکولي به طور گستردهاي مطالعه نشده است. در اين مطالعه، ارتباط ژنتيکي جمعيتهاي بلوط با به کارگيري مارکر SRAP امتحان شد. پنج جمعيت بلوط از مناطق مختلف زاگرس شامل ياسوج، برمدشت، بيستون، آبدانان و خوزستان جمعآوري و آناليز شدند. يازده جفت پرايمر SRAP در کل نمونهها 32 باند از 100 تا 400bp ايجاد کردند. 27 تا از اين باندها پليمورف بودند و درصد پليمورفيسم38/84% به دست آمد. ضريب تشابه ني محاسبه شد و دندروگرام بر اساس UPGMA از روي دادههاي SRAP ترسيم شد. دادههاي SRAP با به کارگيري نرمافزار popgene در چهار خوشه دستهبندي شد. آناليز ژنتيکي دامنه تشابه ژنتيکي بين جمعيتي نسبتاً بالا از حداقل 8818/0 بين ياسوج و برمدشت تا حداکثر 9587/0 بين بيستون و آبدانان را نشان داد. جمعيتهاي مطالعه شده بلوط تنوع بالايي را نشان دادند: شمار آلل موثر 46/1 بود و شاخص تنوع ژنتيکي شانون (I) به طور متوسط 69/41% بود. جمعيتهاي امتحان شده اختلاف ژنتيکي بين جمعيتي نسبتاً بالايي را (2/0 GST=) نشان دادند و جريان ژني(Nem) 96/1 بود.
واژههاي کليدي: بلوط، تنوع ژنتيکي، مارکر مولکولي SRAP، ني، پليمورفيسم
فصل اول:
کليات
1-1 مقدمه و هدف
بلوط (Quercus) از تيره راش (Fagaceae) يکي از متنوعترين جنسهاي درختان نواحي معتدل با بيش از 500 گونه در سراسر جهان است(61). بلوط جزء گياهان پهن برگ است و اساساً اين جنس بومي نيمکره شمالي ميباشد و شامل گونههاي خزانپذير و هميشهسبز ميباشد که در عرضهاي جغرافيايي مختلف آسيا و آمريکا گسترده شدهاست (15). از زمان داروين بلوط به عنوان يک جنس مدل براي مطالعه فرآيندهاي تکاملي و گونهزايي به کار ميرود، سازگاري بالا و مراحل مختلفي از جريان ژني بين گونهاي به طور معنيداري در پيدايش صدها گونه و زيرگونه و اکوتيپهاي متعدد مشارکت داشتهاست(21). از يک طرف اين انعطافپذيري فنوتيپي و تنوع ژني باعث موفقيت اين جنس در گونهزايي شدهاست و از طرف ديگر اين خاصيت مشکلاتي را در تخمين تنوع ژنتيکي بين گونهها و ساختار ژنتيکي جمعيتها و ارتباط تاکسونوميکي بين گونهها ايجاد کردهاست که بايد به طريقي اين مشکل رفع شود(30). يکي از علل عمده اين تنوع ژنتيکي در بلوط فراواني تبادل ژني و دخول بين گونههاي جنس بلوط هيبريداسيون ميباشد(24).
در حال حاضر با فشار ناشي از تخريب و بهرهبرداري از جنگلها توسط انسان، تغييرات اقليم و پديده گرم شدن کره زمين پيشبيني ميشود، طي 50 تا 100 سال آينده جمعيت بسياري از گونههاي گياهي در رويشگاههاي کنوني ضعيف و ضعيفتر شده (3) و آينده جنگلهاي بلوط را با مخاطرات جدي مواجه سازد. همچنين وجود مشکلاتي نظير کمبود درختان مادري، تناوب سال بذردهي، آفات و امراض، توليد دانه ناکافي و نامناسب، ضعف دانهزادي و عدم نگهداري دانهها براي مدت طولاني (63)، روند احياء طبيعي جنگلها را از طريق بذر با مشکل روبرو کردهاست. تدوين برنامه حفاظت از منابع ژنتيکي بلوط و توسعه و احياء جنگلهاي آن از طريق بذرکاري و نهالکاري ميتواند از جمله مهمترين و اصوليترين اقدامات احيايي و حفاظتي رويشگاههاي اين جنس باشد. بطورکلي گزارشات موجود نشان ميدهد که در بسياري از موارد به دليل ناسازگاري ژنتيکي نهالهاي کاشته شده با شرايط محيطي(15)، نرخ پايين زندهماني آنها(51)، بايد توسط بذر ژنوتيپهايي جنگلکاري شود که با شرايط اقليمي دورههاي آينده سازگاري داشته باشد. با اين وجود تنظيم و اجراي برنامههاي حفاظت از منابع ژنتيکي و جنگلکاري با بذر ژنوتيپهاي سازگار با استرسهاي احتمالي نيازمند کسب اطلاع از تنوع ژنتيکي بين و درون جمعيتها است(53).
علاوه بر اهميت اکولوژيکي بلوط، اين جنس داراي مصارف دارويي، خوراکي و صنعتي فراوان نيز ميباشد(28). اين جنس يکي از مهمترين گياهان چوبي تشکيلدهنده جنگلهاي بلوط غرب محسوب ميشود ولي به دليل دور شدن اين جنگلها از حالت کليماکس و کاهش قابل توجه گونههاي جنگلي تعيين تنوع ژنتيکي و حفاظت ذخاير آنها ضروري به نظر ميرسد(23).
مطالعات قبلي مدارک فراواني را مبني بر تنوع بينگونهاي براساس کاراکترهاي فنوتيپي فراهم کردهاند تنوع در اين جنس براساس ويژگيهاي بيولوژيک، مورفولوژيک و فنولوژيک شناسايي و شرح داده شده است، به خصوص مورفولوژي برگ در اين مورد مفيد است و ساختار جمعيت بلوطها بر اساس ويژگي مورفولوژيکي برگ مطالعه شده است (61 و 21). تاکنون مطالعه روي تنوع ژنتيکي درون گونهاي بلوط ايراني در مناطق مختلف ايران با استفاده از مارکر SRAP صورت نگرفته است.
مارکرهاي مولکولي مهمترين و کاربرديترين سيستمهاي مارکري هستند که گستردگي زيادي داشته و هر روزه در حال توسعه و تکامل هستند، و از آنجا که در اولين سطح از بيان ژن مطرح مي شوند خيلي دقيق بوده و داراي تنوع زياد و پلي مورفيسم بالا هستند (15). در بين نشانگرهاي مولکولي ريزماهوارهها به دليل توانمنديهاي ويژهاي که در شناسايي تنوع ژنتيکي ارقام و گونههاي مختلف درختان دارند از کارايي بالايي برخوردارند. هدف از کار حاضر ارزيابي امکان بکارگيري مارکر SRAP در مطالعات ژنتيکي درونگونهاي بلوط و مطالعات ژنتيک جمعيت و سنجش تنوع ژنتيکي در جمعيتهاي مختلف اين گونه و تخمين ساختار ژنتيکي و اختلاف بين جمعيتها در قسمتهاي مختلف قلمرو آن در جنگلهاي زاگرس است که اميد ميرود کمکي در جهت طبقهبندي اين جنس و بهنژادي اين گياه در آينده باشد.
1-2 گياهشناسي تيره راش (Fagaceae)
تيره راش (بلوط يا پيالهداران) در جهان داراي 6 جنس و حدود 600 گونه است. درختان يا درختچههايي يکپايه، خزانکننده يا هميشهسبز هستند. برگها متناوب، ساده، کامل، دندانهدار، کنگرهدار يا داراي لوبهاي شانهاي، دمبرگدار گوشوارکدار که زودافت و در برخي پايا هستند. گلها يکجنسي و در سنبلههاي دمگربه اي مجتمعاند. گلهاي نر داراي کاسهاي کوچک با تعدادي پرچم و گلهاي ماده داراي کاسهاي کوچک چسبيده به 3 تا 6 برچه با تمکن محوري و تخمدان زيرين و داراي خامه و کلالههاي آزاد هستند. در کنار هر برگک سنبلهي ماده معمولا گلآذين گرزني شامل 3 گل وجود دارد که گاهي فقط يک گل از آن به رشد خود ادامه ميدهد. گلهاي ماده را اندامي پيالهاي شکل حاصل از تراکم برگکهاي فلس مانند محصور ميکند که همراه با رشد فندقهها رشد ميکند و نقش حفاظت فندقه را بر عهده ميگيرد. در هر گل فقط يک برچه ميتواند به رشد خود ادامه دهد و به يک فندقه تبديل شود. گاهي گياهشناسان گياهان اين تيره را به دليل داشتن کاسه گل پيالهمانند، که به خصوص در بلوط و شاهبلوط قابل توجه است، پيالهداران نيز ميگويند (10و8).
1-3 شرح تاکسونوميک جنس بلوط Quercus
بلوط يکي از متنوعترين جنسها از درختان نواحي معتدل است که بر اساس گفتهي محققان شمار گونههاي بلوط بين 300 تا 600 متفاوت است (61). در اين جنس سنبله نر به شکل شاتون آويخته و محور آن داراي گلهاي منفردي با پوششي متشکل از پنج قطعه در قاعده است که به هم متصل شده و داراي 5 يا تعدادي پرچم است. سنبله ماده معمولاً کمگل است و غالباً فقط به يک گل يا دو گل ختم ميشود. بخش پايين هر گل را اجتماعي از فلسها به صورت پياله محصور ميسازد. گلپوش داراي 6 قطعه واقع در دو حلقه است. مادگي زيرين و داراي دو تخمک واژگون بوده و خامه به کلاله سهبخشي منتهي است. ميوه بصورت فندقه بزرگي با برونبر چرمي است که قاعدهي آن درون پيالهاي مقاوم قرار دارد. مادگي در جريان رشد تمام تخمکهاي خود را از دست داده و فقط يکي از آنها به رشد خود ادامه ميدهد، بنابراين ميوه بلوط يک فندقهاي است. بيشتر گونههاي بلوط درختان بلند جنگلي با تنههاي ضخيم و چوبي سخت و مقاوم هستند. بلوطها گاهي بيشتر از 200 سال عمر ميکنند (8). بسياري از گونههاي بلوط داراي هر دو نوع توليد مثل جنسي و غيرجنسي هستند. توليد مثل جنسي از طريق توليد دانه و توليد مثل غيرجنسي از طريق پاجوشهاي ريشه صورت ميگيرد و افراد حاصل در پاسخ به فاکتورهاي اکولوژيکي و ژنتيکي متنوع ميشوند (14). ردهبندي بلوط بر اساس ردهبندي کرانکوئيست به صورت زير ميباشد:
Kingdom: Plantae
Division: Magnoliophyta
Class: Magnolipsida
Order: Fagales
Family: Fagaceae
Sub Family: Quercoideae
Genus: Quercus
1-3-1 خصوصيات تاکسونوميک گونه Lindl. Quercus brantii
درختي است که هيچگاه مرتفع نيست (شکل1-3)، حداکثر به ارتفاع 10 متر، با پوست خاکستري، شياردار، شاخههاي جوان با کرکهاي زرد نمدي يا نمدي

منابع پایان نامه ارشد با موضوع حاوي، آنزيمي، وکتور

نهائي جهت هضم آنزيمي انتخاب شدند.
4-2- غربال كردن كلنيهاي E. coli DH5 حاوي pGEM-B1 داراي قطعه
با توجه به طرح اين پلاسميد (شكل8) و محلهاي شناسائي آنزيمهاي محدودكننده بر روي آن انتظار مي رفت كه با هضم اين پلاسميد توسط دو آنزيم BamHI و NdeI قطعه كلون شده با اندازه حدود 1152 جفت باز خارج گردد. همان گونه كه در شكل مشاهده ميشود پلاسميدها پس از استخراج در ژل آگارز %1 الکتروفورز شدند که شکل ذيل را نشان دادند (شکل 7).
6 5 4 3 2 1
شكل 7. الكتروفورز پلاسميدهاي استخراج شده از كلني هاي ترانسفورم شده با pGEM-B1 داراي قطعه.
ستون 1و6: مارکر kp 1 . ستون هاي 2 تا 5 :محصول تخليص پلاسميد pGEM-B1
4-2-1- تاييد پلاسميدهاي استخداج شده با برش آنزيمي NdeI:
پلاسميدهاي pGEM-B1 استخراج شده از سويههاي ترانسفورم شده با استفاده از آنزيم NdeI هضم آنزيمي شد و محصول برش وکتور حاوي ژن سنتتيک با وزن مولکولي 4155 جفت باز بر روي ژل قابل مشاهده شد (شکل 8).
شکل 8. هضم آنزيمي پلاسميدهاي pGEM-B1 حاوي ژن سنتتيک توسط آنزيم NdeI ستون 1 و 3 تا 5: محصول هضم آنزيمي، ستون 2: مارکر 1kb
4-2-2- تاييد پلاسميدهاي خطي شده حاوي ژن سنتتيک با هضم آنزيمي BamHI:
پلاسميدهاي pGEM-B1 حاوي ژن سنتتيک خطي شده توسط آنزيم BamHI هضم آنزيمي شد و قطعه مورد نظر با وزن مولکولي 1152 جفت باز از وکتور 3003 bp جدا شد (شکل9).
شکل 9. هضم آنزيمي پلاسميدهاي pGEM-B1 حاوي ژن سنتتيک خطي شده توسط آنزيم BamHI ،
ستون 1: مارکر 1kb ، ستون 2 و 3 : محصول هضم آنزيمي
4-3- جداسازي قطعه از روي ژل و فرايند Ligation:
کل محصول حاصل از هضم آنزيمي با دو آنزيم NdeI و BamHI که شامل وکتور خطي شده و ژن سنتتيک بود ابتدا بر روي ژل آگارز ران و سپس ژن سنتتيک توسط کيت استخراج ژن از روي ژل تخليص گرديد. غلظت ژن DR2418و وکتور پس از clean up با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر و طبق فرمول زير به دست آمد:
OD260 nm * 50 * Dilution factor = dsDNA concentration (µgr /ml or ng/µl)
0.097 * 50 *1000 = 4850 µgr/ml DR2418 غلظت ژن
0.108 *50*1000=5400 µgr/ml PET21 غلظت وکتور
فرايند Ligation بين وکتور pET21a و ژن dr2418 و ترانسفورم آن به باکتري E.coli DH5? تک كلنيهاي سفيد رنگ بر روي محيط LB agar حاوي آمپي سيلين انتخاب شدند. بمنظور غربال كردن كلنيهاي حاوي ساختار صحيح، پلاسميدهاي استخراج شده از اين كلنيها روي ژل آگارز %1 الكتروفورز شده و پلاسميدهاي سنگين تر كه به نظر مي رسيد داراي قطعه حدود 1152 جفت بازي بودند، به منظور تائيد نهائي با آناليز آنزيمي انتخاب شدند. بدين ترتيب براي هريك از دو ساختار مذكور، يك پلاسميد سنگين انتخاب شد (شکل 10 و 11).
شکل 10. جداسازي قطعه ژن سنتتيک از روي ژل بمنظور تخليص آن-ستون 1:محصول هضم آنزيمي
ستون2 : مارکر1kb
شکل 11. لاين 1: وکتور pET 21a، لاين 2 تا 5: وکتور pET 21a حاوي ژن سنتتيک
4-3-1- تاييد صحت واکنش Ligation ژن در وکتور با روش تعيين توالي:
پلاسميد نوترکيب با استفاده از پرايمر T7 promoter Universal بصورت يک طرفه تعيين توالي شد. نتايج تعيين توالي، صحت سازه ژني از لحاظ ورود ژن، جهت صحيح ورود ژن و عدم وجود جهش در توالي ژن را مورد تاييد قرار داد (شکل 12).
شکل 12. نتايج همرديفي پلاسميد pET21a حاوي ژن مورد نظر (T7 promoter) و ژن سنتز شده (Synthesized).
4-4- ترانفسفورم وکتور pET21a حاوي ژن dr2418 به سلول E. coli Origami و ارزيابي بيان پروتئين DR2418:
پس از تائيد ساختار پلاسميدي نوتركيب pET21a-dr2418توسط آناليز آنزيمي، با ترانسفورم كردن آنها به درون E.coli Origami و انتخاب اتفاقي پنج كلني از روي محيط حاوي آنتي بيوتيكهاي آمپي سيلين و تتراسايکلين، عمل القاء توليد پروتئين توسط IPTG با غلظت نهايي 0.2 mM در مقياس كم انجام شد (2-23). سپس رسوب حاصل از يک ميلي ليتر محيط كشت باكتريائي بر روي ژل اکريلاميد %12.5 به روش SDS-PAGE الكتروفورز شده و با توجه به محل قرارگرفتن باندهاي با اندازه مشخص (ماركر) باند پروتئين DR2418 توليد شده توسط پلاسميد pET21a-DR2418 با اندازه حدود 41.519 كيلودالتون شناسائي شد. (شکل 13)
4-5- شناسائي و تائيد پروتئين DR2418 با روش Western Blot Wet transfer))
به منظور شناسائي و تائيد باند منسوب به پروتئين DR2418، پس از الكتروفورز نمونههاي پروتئيني در كنار ماركر عمل انتقال آنها به غشاء نيتروسلولزي صورت گرفت. پس از انكوباسيون غشاء با رقت 2000/1 از آنتي بادي ضد His-tag، اتصال آن به برچسب هيستيديني توسط استفاده از آنتي بادي ثانويه Anti-mouse-peroxidase-conjugate متصل به HRP، پس از افزودن محلول DAB بررسي شد. با مقايسه غشاء رنگ شده Western blot و ژل SDS-PAGE هم ارز آن مشاهده ميشود كه تنها پروتئينهاي رديابي شده در روي غشاء باندهاي منسوب به پروتئين DR2418 در ستون بعد از القاء بودند (شکل 14).
شكل 13. بررسي الگوي پروتئيني DR2418 بيان شده در E. coli Origami با روش SDS-PAGE: ستون 1، 5، 7 و 9: رسوب E. coli Origami حاوي پلاسميد قبل از القا بعنوان كنترل منفي. ستون 4: unstain Ladder، ستونهاي 2، 3، 6، 8 و 10: رسوب باكتري E. coli Origami حاوي pET21a- DR2418 چهار ساعت بعد از القاء

منابع پایان نامه ارشد با موضوع حاوي، پروتئين، ميلي‌ليتر

يكسان سازي غلظت كلي پروتئينها در نمونه هاي قبل و بعد از القا جهت انجام SDS-PAGE
براي اين منظور قبل و بعد از القاء جذب نوري (OD600) باكتريها در محيط كشت ثبت شده و با ضرب كردن آن در عدد 71 ميزان افزودن SDS-PAGE Sample buffer (بر اساس ميكروليتر) به رسوب باكتريها بدست مي آيد. در مرحله بعد به همان ميزان نيز آب مقطر به نمونهها افزوده شده، به اين ترتيب با ريختن مقدار 12 ميكروليتر از هر نمونه در چاهك ميتوان انتظار داشت كه غلظت كلي پروتئينها در ستونهاي ايجاد شده بر روي ژل تقريباً يكسان باشد و تنها در باند مربوط به پروتئين بيان شده تفاوت ديده شود.
3-8- شناسائي و تائيد پروتئين His-tagged r-DR2418 با روش Western blot
در اين روش پس از انجام الكتروفورز SDS-PAGE بر روي نمونه هاي قبل و بعد از القاء، ابتدا كليه پروتئينهاي الكتروفورز شده موجود در ژل به يك غشاء نيتروسلولزي مخصوص منتقل شده (transfering) و سپس با استفاده از آنتي بادي ضد His-tag يا Anti-penta-His Ab و نيز آنتي بادي كنژوگه با آنزيم HRP، باندهاي پروتئيني داراي بر چسب هيستيدني مورد شناسائي قرار خواهند گرفت .(Detecion) براي اين منظور تعدادي قطعه كاغذ واتمن و يك قطعه غشاء نيتروسلولزي درست به اندازه ژل برش داده شده و درون بافر انتقال يا tank blotting transfer buffer قرار داده مي شوند. ژل الكتروفورز شده نيز به اين بافر منتقل ميشود . سپس با حذف حبابهاي هوا توسط غلطاندن يك پي پت پاستور بر روي هر لايه كاغذ، چهار لايه كاغذ فيلتر بر روي ابر مخصوص دستگاه انتقال (fiber pad) منتقل شده و پس از آن به ترتيب ژل و غشاء نيتروسلولز نيز بر روي اين چهار لايه قرار داده مي شوند. در اين مرحله تعدادي كاغذ فيلتر ضمن خارج كردن حبابهاي هوا بر روي غشاء نيتروسلولز قرار گرفته و با گذاشتن ابر مخصوص ديگري بر روي آخرين كاغذ، مجموعه به درون تانك blotting انتقال داده مي شود بطوريكه ژل به سمت قطب منفي و غشا به سمت قطب مثبت قرار گرفته باشد. سپس مخزن دستگاه از بافر انتقال پر شده و جريان برق مستقيم به ميزان mA/cm2 8/0 براي مدت يک شبانه روز برقرار ميگردد. پس از پايان عمل انتقال ميتوان غشاء را جهت ارزيابي كارائي انتقال به مدت دو دقيقه در محلول رنگي مركب از 5/0 درصد ponceou S و 1% اسيد استيك قرار داد و سپس با آب مقطر رنگ اضافي را شست تا باندها ظاهر شوند.
بعد از اين مرحله براي شناسائي پروتئين مورد نظر و تائيد آن مطابق روش زير عمل مي شود (QLAexoress, 1999):
1. کاغذ PVDF دوبار و هر بار به مدت ده دقيقه در بافر TBS-Tween/triton شسته ميشود.
2. به مدت يک و نيم ساعت در بافر TBS-Tween20 حاوي 3% BSA در دماي اتاق انكوبه ميگردد.
3. سه بار و هر بار به مدت پنج دقيقه در بافر TBS-Tween/triton در دماي اتاق شسته مي‌شود.
4. انکوباسيون کاغذ در بافر TBS-Tween حاوي Anti- His Tag Ab (?g/ml 2/0) و 3% BSA به مدت 1 ساعت در دماي اتاق
5. سه بار و هر بار به مدت پنج دقيقه در بافر TBS-Tween/triton در دماي اتاق شسته مي- شود.
6. انکوباسيون کاغذ در بافر TBS-Tween حاوي Anti- mouse-peroxidase-conjugate به ميزان يک حجم آنتي بادي ثانويه به 1000حجم بافر (TBS-Tween20) و 3% BSA به مدت يک و نيم ساعت در دماي اتاق.
7. مجددا سه بار شستشو
10- تعيين باند آنتي بادي توسط TBS-Tween حاوي سوبستراي آنزيم پراکسداز کونژوگه شده به آنتي بادي ثانويه به نام DAB و کاتاليزور H2O2
11- با ريختن آب بر روي کاغذ واكنش رنگ زائي متوقف ميگردد.(Joe S,Molecular cloning, 2001)
3-9- نگهداري و ذخيره باكتريهاي مولد پروتئين ِDR2418:
پس از انجام بهينه سازي بيان و بدست آوردن كلونهائي از باكتري E. coli كه بيشترين ميزان توليد ِDR2418 را داشتند، براي نگهداري آنها از كشت شبانه كلون در محيط مايع حاوي آنتي بيوتيك هاي لازم، مخلوط گليسروله مركب از محيط كشت باكتري و گليسرول استريل (با غلظت نهايي 25 درصد) درون ميکروتيوب مخلوط شد و در دماي 70- درجه سانتي گراد قرار داده شد. با اين روش در دماي 70- مي توان تا چند سال باكتريها را زنده نگهداشت.
البته لازم به ذكر است كه در هر بار خروج باكتريها از 70- درجه و يا يخچال، قبل از القاء آنها با IPTG تست پايداري پلاسميد انجام شده و از وجود پلاسميد بياني در باكتريها اطمينان حاصل شود.
3-10- بررسي پايداري پلاسميدها (Plasmid stability Test)
براي اين منظور دوپليت A (حاوي محيط LB agar) و B (حاوي محيط LB agar داراي ?g/ml 50 Amp و?g/ml30Tet ) تهيه شدند. از كلون مورد نظر يك كشت شبانه در cc5 محيط TY2x داراي آنتي بيوتيك تهيه شده و روز بعد ml1 از آن به ml10 محيط تازه حاوي آنتي بيوتيك منتقل گشت و در 37 درجه تا زمان رسيدن 6/0 – 4/0 OD600 شيك شد. با اين فرض كه يک واحد OD600 برابر با cell/ml 10*8 مي باشد ، محيط كشت مذكور بصورت متناوب با سرم فيزيولوژي طوري رقيق شد كه تعداد 200-100 سلول براي هر پليت بدست آمد. سپس غلظت بدست آمده بر روي هر دوپليت ، كشت داده شده و پس از انكوباسيون شبانه روز بعد تعداد كلونيهاي دوپليت مقايسه شدند. كمتر بودن تعداد كلونهاي رشدكرده بر پليت B نشانه از دست دادن پلاسميد و كاهش پايداري پلاسميد مي باشد (37). نكته مهم اينكه كاهش پايداري پلاسميد بويژه در مواقع سمي بودن محصول ژن كلون شده، بسيار شايع بوده و بررسي آن قبل از انجام القاء اهميت ويژه اي دارد. (Joe S, Molecular cloning, 2001)
3-11- خالصسازي پروتئين نوترکيب DR2418 به روش کروماتوگرافي
تجهيزات
* ست استاندارد کروماتوگرافي (فارماسيا) شامل پمپ پريستالتيک، ستون XK16/20، گراديان ميکسر، فراکشن کالکتور، دتکتور UV
* دستگاه اسپکتروفتومتر uv/vis (فارماسيا)
* سيستم الکتروفورز (فارماسيا)
* شيکر معمولي
* همزن مغناطيسي يا مگنت استيرر
* کيسه دياليز
3-11-1- ليز سلولي باکتري E.coli
باكتري E.coli تولد كننده پروتئين نوتركيب همراه با دنباله هستيديني در 1 ‌ليتر محيط كشت، رشد داده شد.
سلولهاي E.coli توسط سانتريفوژ (min 10 و rpm 8000) رسوب داده شد.
رسوب سلولي در 100 ميلي‌ليتر بافر A (20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 0.3% TritonX100, 0.005% PMSF, 10mM Imidazole, pH8.0) سوسپانسيونه شده و توسط سونيكاتور در 10 سيكل 40 ثانيه‌اي تحت شرايط 4 درجه سانتي گراد شكسته شد.
سوسپانسيون حاصل، سانتريفوژ (°C 4 ،min20 و rpm 12000) و سوپرناتانت جمع‎آوري شد.
بمنظور حذف ذرات نامحلول که باعث مسدود شدن و خرابي ستون ميشوند، سوپرناتانت پروتئيني از فيلتر ? 45/0 عبور داده شد.
3-11-2- آماده كردن ستون
1- 20 ميلي‌ليتر رزين (Chelating Sepharose Fast Flow) با 140 ميلي‌ليتر آب مقطر دوبار تقطير در ستون كروماتوگرافي توسط پمپ پريستالتيك شستشو داده شد.
2- 10 ميلي‌ليتر محلول 1/0 مولار NiSO4 از ستون عبور داده و شستشو با 140 ميلي‌ليتر آب مقطر دوبار تقطير ادامه يافت.
3- ستون با 200 ميلي‌ليتر بافرA (20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 0.3% TritonX100, 0.005% PMSF, 10mM Imidazole, pH8.0) به تعادل رسانده شد. در اين مرحله، عبور بافر تعادل تا هنگامي كه محلول خروجي ستون به pH 8.0 برسد، ادامه يافت.
3-11-3- تزريق نمونه و شستشو
* سوپرناتانت پروتئيني با سرعت جريان كم ( 1 ميلي ليتر در دقيقه ) از ستون عبور داده شد و بمنظور اتصال بيشتر خروجي متصل نشده به ستون، يکبار ديگر از ستون عبور داده شد.
* ستون با 150 ميلي‌ليتر بافر B (20mM Tris, 0.5 M Nacl, 20mM Imidazole, pH 8.0) شستشو داده شد. اين مرحله از شستشو تا هنگامي كه OD280nm خروجي ستون به صفر برسد، ادامه يافت.
3-11-4- جدا سازي يپروتئين نوترکيب
1- پس از مرحله شستشو، پروتئين نوتركيب مورد نظر با افزايش شيب غلظت ايميدازول با استفاده از بافر B و بافر C (همان بافر B حاوي 600 ميلي‌مولار ايميدازول) از ستون جدا گرديد. براي ايجاد شيب غلظت ايميدازول از سيستم ايجاد كننده شيب غلظت (گراديان ميكسر) استفاده شد كه در آن بافر B كه حاوي 20 ميلي‎مولار ايميدازول است بعنوان غلظت پائين با حجم 40 ميلي‎ليتر و بافر C كه حاوي 600 ميلي مولار ايميدازول است با حجم40 ميلي‎ليتر بعنوان غلظت حداكثر بكار برده شد. به تدريج با افزايش غلظت ايميدازول از 20 ميلي‎مولار به 600 ميلي‎مولار، پروتئين نوتركيب داراي دنباله هيستيدني از ستون جدا مي‎گردد.
2- پس از جمع‌آوري فراكسيونهاي پروتئيني، بمنظور بررسي خلوص آنها، آناليز الکتروفورز SDS-PAGE انجام شد.(شکل16).
3- بمنظور حذف ايميدازول از محلول پروتئيني، با استفاده از روش دياليز، تعويض بافر با بافر فرمولاسيون انجام شد . (Joe S, Molecular cloning, 2001)
3-11-4-1- روش دياليز
1- كيسه دياليز به طول cm 10 (با گنجايش حدود 8 ميلي‎ليتر) بريده شد.
2- كيسه دياليز در آب مقطر دوبار تقطير به مدت 45 دقيقه جوشانده شد.
3- كيسه دياليز پس از جوشاندن، با آب مقطر دوبار سرد، شسته شد.
4- يك سمت كيسه دياليز با نخ محكم بسته شد.
5- محلول پروتئيني خالص در درون كيسه دياليز ريخته شد.
6- انتهاي ديگر كيسه دياليز محكم بسته شد.
7- كيسه دياليز محتوي محلول پروتئيني خالص به مدت 12-6 ساعت در 500 ميلي ليتر بافر فرمولاسيون PBS (1.9 mM NaH2PO4.2H20, 8mM Na2HPO4, 0.15M Nacl+ 0.1M Sucrose+ 0.04% Tween 80, pH7.4) در دماي يخچال توسط همزن مغناطيسي انکوبه شد.
3-11-5-1- رسم منحني استاندارد
منحني استاندارد با استفاده از تعيين ميزان جذب يک نمون? استاندارد در غلظتهاي مشخص رسم ميشود. معمولاً از سرم آلبومين گاوي به عنوان نمون? استاندارد استفاده ميشود. اگرچه اين پروتئين رايجترين پروتئين خالص براي رسم منحني كاليبراسيون است، اما نميتواند هميشه به عنوان يک استاندارد کامل و تمام عيار عمل نمايد. نمودار استاندارد به ترتيب ذکر شده در ذيل رسم ميشود:
مقادير مربوط به غلظت پروتئين را در محور x منحني استاندارد، و مقادير مربوط به ميزان جذب در محور y منحني استاندارد قرار ميگيرند. محلولهاي متغيير BSA با طيفهاي غلظتي50،100،250 و500 ميليگرم بر ليتر تهيه شد.جذب هريک از محلولهاي متغير BSA در 595 نانومترخوانده شد.
پس از خواندن تمامي جذبها، نمودار استاندارد بر اساس غلظت و جذب رسم شد.
3-11-5-2- تهي? محلول برادفورد
محلول 5X : 100ميليگرم كوماسي بلو در50ميليليتر متانول حل شده، سپس 100ميليليتر اسيد فسفريک 85% افزوده و در نهايت 50ميليليتر آب مقطر افزوده ميگردد. حجم نهائي محلول بايد 200ميليليتر باشد. محلول1X، حاوي 1حجم محلول + 5X4 حجم آب مقطر با 1/1PH~ ميباشد، که با فيلتر واتمن شماره يك صاف و در تاريكي نگهداري ميشود.
3-11-6- بازيافت و نگهداري ستون
1- بازيافت ستون فوق با 50 ميلي‌ليتر بافر (20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 50mM EDTA, pH8.0) انجام شد.
2- ستون پس از شستشو با 200 ميلي‌ليتر آب مقطر، با 250 ميلي‌ليتر اتانول 20درصد شسته شد.
3- ستون در دماي °C 4 و در اتانول 20 درصد نگهداري ‎شد.
فصل چهارم:
نتايج
4-1- غربال كردن كلني هاي حاوي pGEM-B1 داراي قطعه DR2418:
پس از ترانسفورم وکتور pGEM-B1 حاوي ژن dr2418 به باكتريهاي E. coli DH5?، كلنيهاي رشد يافته بر روي محيط LB agar حاوي آنتي بيوتيک آمپي سيلين انتخاب شدند. به منظور غربال كردن كلنيهاي حاوي ساختار صحيح، پلاسميدهاي استخراج شده از اين كلنيها روي ژل آگارز %1 الكتروفورز شده و پلاسميدهاي سنگين تر كه به نظر ميرسيد داراي قطعه حدود 1152 جفت بازي بودند، به منظور تائيد

منابع پایان نامه ارشد با موضوع ميکروليتر، حاوي، پروتئين

م BamHI انجام شد. مواد زير در يک ميکروتيوپ افزوده شد و حجم کل توسط آب مقطر به 100 ميکروليتر رسيد و سپس ميکروتيوب 4 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتيگراد قرار داده شد.
15 µl
pGEM/dr2418
4 µl
BamHI enzyme
10 µl
Enzyme Buffer
71 µl
H2o
3-3-9- تخليص ژن سنتتيک dr2418 از روي ژل
کل محصول برش وکتور حاوي ژن سنتتيک pGEM/DR2418با آنزيم BamHI (100 ميکروليتر) بر روي ژل 1% در يک چاهک بزرگ متناسب با حجم محصول ران شد. سپس مارکر در چاهک ديگر اضافه شد. پس از ران کردن نمونه، به طور مستقيم توسط U.V دو باند شارپ در ژل مشاهده شد. باند مورد نظر حاوي ژن توسط تيغ بريده شد و در ميکروتيوپ منتقل شد و مراحل تخليص روي آن انجام شد.
1. 50 ميکروليتر از بافر شماره يک (TBE convertion) اضافه شد. اين بافر فرآيند ذوب ژل را تسهيل مي کند.
2. 700 ميکروليتر از Binding buffer به ژل افزوده شد و 5 دقيقه در بن ماري 55 درجه سانتيگراد قرار داده شد.
2. 10 ميکروليتر پودر سيليکا به ميکروتيوپ اضافه شده، به طور کامل سوسپانس شده و دوباره به مدت 5 دقيقه در بن ماري 55 درجه سانتيگراد قرار داده شد و هر دو دقيقه يکبار تکان داده شد.
3. سپس ميکروتيوپها Spin شده و pellet ايجاد گرديد.
4. محلول رويي اوت شده و 500 ميکروليتر بافر شستشو به رسوب اضافه گرديد تا سوسپانسيوني يکنواخت داد.
5. ميکروتيوپ دوبارهSpin شد و محلول رويي اوت شده و شستشو تکرار گرديد.
6. بعد از شستشوي دوم چند دقيقه زمان داده شده تا ميکروتيوپها خشک شود.
7. سپس 20 ميکروليتر آب مقطر اضافه شد.
8. ميکروتيوپها دوباره 5 دقيقه در بن ماري 55 درجه سانتيگراد قرار داده شد.
9. سپس ميکروتيوپ 30 ثانيه Spin شد که DNA در آب حل شده و سيليکا در ته لوله باقي ميماند. 10. DNA را به ميکروتيوپ ديگر منتقل کرده و سيليکا اوت گرديد. مرحلهSpin را چند بار تکرار کرده تا ديگر سيليکايي در ميکروتيوپ باقي نماند. براي تأييد صحت تخليص، يک ميکروليتر از محصول الکتروفورز شد.
3-3-10- برش پلاسميد pET-21a توسط آنزيم Nde?
براي هضم آنزيمي وکتور pET-21a توسط آنزيم Nde?، مواد زير در يک ميکروتيوپ افزوده شد و حجم کل محلول به 100 ميکروليتر رسانده شد. ميکروتيوب دو ساعت در انکوباتور در دماي 37 درجه سانتيگراد انکوبه شد. سپس براي تأييد صحت برش دو ميکروليتر از محصول برش در ژل الکتروفورز ران شد. سپس وکتور برش خورده با کيت تخليص گرديد.
20 µl
pET 21a
2 µl
NdeI enzyme
10 µl
Enzyme Buffer
68 µl
H2o
3-3-11- برش وکتور pET-21a (هضم شده با Nde?) توسط BamHI
وکتور pET-21a که قبلاً توسط آنزيم Nde? هضم و تخليص شده بود، همراه با آنزيم BamHI و آب به حجم کلي 100 ميکروليتر رسانده شد تا هضم آنزيمي اين وکتور توسط آنزيم BamHI صورت گيرد. سپس براي تأييد صحت هضم آنزيمي دو ميکروليتر بر روي ژل برده شد.
20 µl
pET 21a
2 µl
BamHI enzyme
10 µl
Enzyme Buffer
68 µl
H2o
قبل از انجام مرجلة ليگاسيون، از وکتور برش خورده و ژن سنتتيک به مقدار يک ميکروليتر روي ژل برده شد.
3-3-12- ليگاسيون وکتور pET-21a و ژن سنتتيک dr2418
براي تعيين غلظت مواد استفاده شده ابتدا با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر OD وکتور و ژن مرد نظر را در nm260 اندازه مي گيريم . به اين ترتيب که به lµ 999 آب lµ1 از DNA (وکتور يا ژن) اضافه ميکنيم و OD آن را اندازه مي گيريم و با استفاده از فرمول زير غلظت آن را اندازه مي گيريم:
OD260 nm * 50 * Dilution factor = dsDNA concentration (µgr /ml or ng/µl)
براي ايجاد وکتور نوترکيب pET/ dr2418 مواد زير در يک ميکروتيوب افزوده شد و حجم کلي توسط آب مقطر به 20 ميکروليتر رسانده شد (Aasubel FM, 1999).
9 µl
dr2418
3 µl
pET 21a
1 µl
Ligase Enzyme
2 µl
Enzyme Buffer
5 µl
H2o
3-3-13- ترنسفورماسيون pET/ dr2418 در سلول مستعد DH5?
سلولهاي E.coli DH5? (مطابق پروتکل شرح داده شده در قسمت قبل) مستعد شده و محصول ليگاسيون به آن ترنسفرم شد. سپس روي محيط LB agar حاوي آمپيسيلين کشت داده شد و يک شب در 37 درجه سانتيگراد قرار داده شدند. روز بعد از کلنيهاي بدست آمده در محيط LB broth حاوي آمپيسيلين کشت داده شده و بعد از رشد، استخراج پلاسميد انجام شد. براي تأييد پلاسميدهاي حاوي ژن، دو ميکروليتر از آنها به همراه pET-21a فاقد ژن سنتتيک ران شد.
3-4- توالييابي ژن سنتتيک در pET-21a
به منظور تاييد سازه ژني pET21a-dr2418، پلاسميد استخراج شده براي توالييابي انتخاب به شرکت Macrogen کره جنوبي ارسال شدند. تعيين توالي با استفاده از پرايمر Universal T7 forward و بصورت يک طرفه انجام شد. نتيجة توالييابي نشان داد ژن سنتتيک در وکتور pET 21a با موفقيت کلون شده است. در ادامه پس از تائيد اين وکتور نوترکيب با انجام الکتروفورز و توالي يابي، به ميزبان بياني E. coli Origami منتقل شد. پس از گزينش اتفاقي كلونيهاي رشد كرده بر روي محيط حاوي دو آنتي بيوتيك آمپي سيلين و تتراسيكلين، پنج کلني بصورت تصادفي جهت بيان پروتئين نوترکيب انتخاب و براي مرحله القاء و بيان نگهداري شدند.
3-5- القاء ساختارهاي بياني pET21a-dr2418 توسط IPTG به منظور توليد پروتئين DR2418 داراي برچسب هيستيدين (His-tagged r-dR2418):
بعد از بدست آوردن كلون حاوي ساختار نوتركيب مناسب در سوش E. coli Origami مراحل زير به منظور القاء توليد پروتئين DR2418 در مقياس كم انجام شد:
ابتدا در پنج ميلي ليتر از محيط LB broth حاوي آنتي بيوتيكهاي لازم (آمپي سيلين و تتراسيكلين) يك كشت شبانه از تك كلني مورد نظر تهيه مي شود. غلظت نهايي آنتي بيوتيك به ترتيب عبارتند از 0.1 mg/ml (Amp) و 0.2 mg/ml (TET) مي باشد. صبح روز بعد پس از ورتكس لوله مقدار ?l200 از اين محيط به ml 10 از محيط تازه و گرم TY2x حاوي آنتي بيوتيك لازم انتقال داده شده و در rpm 150 در دماي 37 درجه سانتي گراد تا رسيدن جذب نوري محيط در طول موج nm 600 (OD 600) به 6/0 – 4/0 شيك مي شود. در اين هنگام پس از ثبت جذب نوري دقيق محيط كشت باكتري در طول موج مذكور ، مقدار يک سي سي از آن را به درون يك ويال منتقل كرده و در rpm 9000 به مدت سه دقيقه سانتريفوژ مي نمائيم و رسوب حاصل را نيز يك بار با سرم فيزيولوژي شستشو داده و پس از خشك شدن در دماي 20- درجه سانتي گراد نگهداري مي نمائيم. اين نمونه تحت عنوان كنترل قبل از القاء، در هنگام الكتروفورز استفاده خواهد شد. به بقيه محيط كشت (cc4) مقدار 8 ميکروليتر از IPTG با غلظت نهايي0.2 mg/ml مي افزائيم. لوله حاوي محيط را مجدداً به انكوباتورشيكر دار برگردانده و براي مدت چهار ساعت با دور rpm 150 در دماي 37 درجه سانتي گراد شيك شد. پس از پايان انكوباسيون مجدداً OD600 محيط را ثبت نموده و در پنج ميکروتيوب به طريق گفته شده رسوب حاصل از يک سي سي محيط كشت را بدست آورده و پس از شستشو با سرم فيزيولوژي و خشك كردن، تا زمان انجام الكتروفورز يا تخليص، در 20- درجه سانتي گراد قرار داده شد. پنج لوله مذكور رسوب حاصل از باكتريهاي القاء شده را داشته و دو عدد از آنها را مي توان در مرحله بعد جهت تخليص پروتئين با دو روش Native و Denaturing بكار برد. رسوب تهيه شده در لوله سوم را بعنوان نمونه بعد از القاء مي توان با مقدار مناسب از SDS-PAGE Sample buffer مخلوط نموده و در كنار رسوب حاصل از باكتريهاي قبل از القاء كه به همين ترتيب آماده شده است با روش SDS-PAGE الكتروفورز نمود و به اين وسيله بيان پروتئين DR2418 را ارزيابي كرد. در اين تحقيق در مواقعي كه هدف از تخليص پروتئين بيان شده، انجام Western blot و يا سنجش فعاليت DR2418بود، از القاء در حجم زياد استفاده مي شد كه براي اين منظور كشت اوليه شبانه در 10 سي سي از محيط تهيه شده و روز بعد مقدار پنج ميلي ليتر از اين محيط به يک ليتر ديگر از محيط تازه در ارلن دو ليتري منتقل شده و با مقدار مناسب IPTG القاء‌ صورت مي گرفت (QLAexpress, 1999).
3-6- ارزيابي پروتئين DR2418 توليد شده به وسيله الكتروفورز در ژل پلي آكريلاميد (SDS-PAGE)
در اين روش پروتئينها در حضور يك دترجنت يوني به نام سديم دو دسيل سولفات (SDS) يا لوريل سولفات واسرشته شده و در اثر احياء كننده اي چون 2-مركاپتواتانل (2ME) باندهاي دي سولفيدي آنها شكسته شده، زير واحدهاي ساختماني آنها از هم جدا مي شوند. SDS از قسمت غير قطبي خود به نواحي غير قطبي زنجيره هاي پروتئين متصل مي شود و به صورت پوششي با بار منفي تمام سطوح پروتئين را مي پوشاند. در اين حالت بارهاي منفي روي پروتئين در مقايسه با بار منفي SDS بسيار ناچيز مي باشند، ضمن اين كه بارهاي مثبت پروتئين نيز خنثي مي شوند. نتيجه اين عمل يكسان شدن چگالي بار الكتريكي پلي پپتيدهاي حاصل است. در نتيجه تاثير بار الكتريكي مولكولها در الكتروفورز حذف شده و مولكولها براساس ميزان جرم مولكولي خود حركت ميكنند.
در سيستم ناپيوسته كه در 1970 توسط Laemmli بنا نهاده شد قسمتهاي مختلف ژل از نظر pH و قدرت يوني با هم تفاوت دارند. در اين تحقيق ژل متراكم كننده (stacking or spacer gel) به صورت 5% و ژل جدا كننده (Resolving or separating gel) با توجه به وزن مولكولي پروتئين DR2418 به صورت 12.5% تهيه شدند. براي اين منظور پس از سر هم كردن دستگاه الكتروفورز عمودي،‌ فاصله بين دو شيشه قالب ژل با يک ميلي ليتر از ژل پايين و ده ميکروليتر از TEMD اصطلاحا آب بندي شد و سپس ژل جدا كننده كه تازه تهيه شده است تا جايي كه فضاي كافي براي ژل متراكم كننده (به اندازه طول دندانه شانه بعلاوه يک سانتي متر) باقي بماند، در فضاي بين دو شيشه ريخته شد. پس از پليمريزه شدن كامل ژل (حدود 30 دقيقه) الكل روي آن با برگرداندن شيشه خالي شده و سطح ژل نيز با آب مقطر شسته مي شود. در مرحله بعد ژل متراكم كننده نيز تهيه شده و به محض افزودن TEMED به درون قالب بر روي ژل قبلي ريخته مي شود و يك شانه تميز در درون ژل متراكم كننده قرار داده مي شود. در اين حالت ژل به صورت عمودي در دماي اتاق براي حدود 30 دقيقه باقي مي ماند تا كاملاً پليمريزه گردد. سپس شانه با احتياط خارج شده و پس از شستن درون چاهكها با كمك يك سرنگ و آب مقطر، ژل تهيه شده در قسمت مخصوص دستگاه الكتروفورز قرار داده مي شود. سپس بافر الكتروفورز Tris-glycine را در محفظه هاي بالا و پائين ريخته و حبابهاي هواي گير افتاده در پائين ژل را با كمك يك سرنگ كج شده خارج مي كنيم.
نمونه ها بايد قبل از اين كه به درون چاهكها ريخته شوند با مقدار مناسبي از SDS- PAGE Sample buffer يا Laemmli buffer مخلوط شده و به مدت پنج دقيقه در آب جوش قرار داده شوند. به اين ترتيب بعد از انجام ورتکس، مقدار مناسب از نمونه ها را كه عموماً شامل نمونه هاي قبل از القاء، بعد از القاء، ماركر و احتمالا نمونه هاي تخليص شده مي باشند در درون چاهكها ريخته و جريان mA 10-5 تا زمان رسيدن رنگ آبي به انتهاي ژل (3 ساعت) برقرار مي گردد(Ausubel FM, 1999).
پس از انجام الكتروفورز ژل به ظرف حاوي ml‌20 رنگ coomaassie brilliant blue (ضميمه ب) منتقل شده و براي مدت 40-20 دقيقه شيك ميشود، سپس با آب شسته شده و در ظرف حاوي محلول رنگ بر (destaining solution) قرار داده ميشود تا باندها كاملاً مشخص شوند. به منظور رنگ بري سريعتر ميتوان ظرف حاوي محلول رنگ بر و ژل را بر روي شيكر و در دماي 45 درجه قرار داد. رنگ آميزي با كوماسي بلو قادر به نشان دادن ?g1/0 از پروتئين در يك باند تنها ميباشد (Glover DM, 1995).
3-7-

منابع پایان نامه ارشد با موضوع حاوي، ميکروليتر، دقيقه

ساختار مولکولي پيچيده از لحاظ هزينه مقرون به صرفه نمي باشد. پيشنهاد ميگردد توليد باکتريايي ملانين، يک راه ارزان و نسبتا آساني است. علاوه بر اين، تحقيقات آينده در پالايش محيط کشت، ارتباطات سلول سلول و نوآوري با توان عملياتي بالا مي تواند منجر به ايجاد بينش جديدي نسبت به محيط هايي که زماني تصور مي شد اشکال پنهاني از حيات در آن وجود ندارد، منجر شود. با وجود پيشرفت هاي کنوني در حوزه بيوتکنولوژي، هميشه محدوديتهايي در توليد اکستريموليت هاي موثر جهت استفاده انساني وجود داشته است. يکي از عوامل اصلي محدود کننده در تجاري سازي اکستريموزيم و اکستريموليت ها، شناسايي محيط کشت صحيح جهت به حداکثر رساندن توليد است. اين محيط ها نيازمند به مواد مغذي، pH و سطوح درجه حرارت مناسب ميباشند. حتي گاهي تغييرات جزئي در دما و pH تا حد زيادي ميتواند متابوليسم اکستريموفيل ها را تحت تاثير قرار دهد. مقدار مواد مغذي ضروري مورد نياز، همچنين محدوديت غلظت محصول؛ با اين حال براي غلبه بر محدوديت مواد غذايي، کشت بسته به طور گسترده رواج يافته و در حال حاضر اغلب براي فرايندهاي کشت سلولي استفاده مي شود. علاوه بر اين، بهبود بخشيدن محصول به عنوان يکي از بزرگرين عوامل محدود کننده در تجاري سازي اکستريموزيم و اکستريموليت ها در نظر گرفته مي شود (Copeland E, 2012). راهبردهاي مختلفي در طي تکامل در باکتريها و آرکي ها جهت رهايي از آسيب هاي ناشي از اشعه بوجود آمده است. مقايسه باکتري هاي مقاوم به اشعه و آرکي ها راهکارهاي رايج از جمله محدود کردن توليد ROS و يا از بين بردن راديکال هاي آزاد و ترميم شکست DNA دورشته اي را نشان مي دهد. بااين حال بعضي از راهکارها فقط در گونه هاي خاصي وجود دارد مانند اينکه بعضي از باکتري هاي مقاوم به اشعه غلظت هاي کمي از آهن را براي جلوگيري از توليد OH. نشان مي دهند و حفاظت از پروتئين هاي D. radiodurans عليه اکسيداسيون نقش مهمي را در ترميم جراحات سلولي ايفا مي کند و بعضي از باکتري هاي مقاوم به اشعه رنگدانه توليد مي کنند. D. radiodurans ترميم شکست DNA دورشته اي را با سنتز بيش از حد DNA ترکيب مي کند. هم چنين پروتئينهاي دخيل در سازماندهي نوکلئوئيد در باکتريهاي مقاوم به اشعه يکسان نيست. با اين وجود مکانيسم مقاومت به اشعه پيچيده بوده و نيازمند مطالعات بيشتر در سطح مولکولي مي باشد.
با توجه به اثرات سودمند اکستريموليتها در باکتريهاي اکستريموفيل و الگو گرفتن از آن ها ميتوان با استفاده از فن آوري زيستي و مهندسي ژنتيک اين ترکيبات را توليد کرده و در جهت منافع انساني مورد استفاده قرار داد. اما هدف از اين مطالعه کلون و بيان ژن کد کننده مقاومت به پرتو در ميزبان بياني E. coli بود. به اين ترتيب که اکستريموليت توليد شده توسط باکتري مقاوم به پرتو (داينوکوکوس) به نام پروتئين DR2418 به عنوان الگو قرار گرفت و ژن کد کننده اين پروتئين بصورت سنتتيک ساخته شد و در ميزبان E. coli بيان شد.
فصل سوم:
مواد و روشها
عناصر و مواد شيميايي
ليست كليه مواد شيميايي و كمپانيهاي سازنده آنها در ضميمه موجود مي باشد.
محلولها و بافرها
تركيب و روش تهيه محلولها و بافرهاي مختلف در ضميمه آورده شده است.
سوشهاي باكترياني
در اين تحقيق از چند سوش باكتري E. coli استفاده شده است كه عبارتند از DH5-?‌، Origami، كه مشخصات و ژنوتيپ آنها در ضميمه موجود است.
محيطهاي كشت
در اين تحقيق از محيط كشت باكتريائي به نام هاي LB ((Luria Bertani استفاده شده است كه تركيب و روش تهيه آنها در ضميمه موجود مي باشد.
3-1- آماده سازي وکتور pGEM-B1 حاوي ژن سنتتيکdr2418-opti
زمانيکه ژن سنتتيک dr2418-opti دريافت گرديد در وکتور pGEM-B1 کلون شده بود. اين وکتور به صورت ليوفيليزه بود که 20 ميکروليتر آب به آن اضافه شده و يک ميکروليتر آن به باکتري E.coli DH5? ترنسفرم شد. براي اين کار ابتدا باکتري به صورت مستعد درآمد و سپس انتقال وکتور صورت گرفت.
3-2- مستعدسازي E.coli DH5?
1. باکتري E.coli DH5? در محيط LB Broth کشت داده شد و به مدت يک شب در انکوباتور شيکردار 37 درجه سانتيگراد قرار داده شد. بعد از رشد باکتري 200 ميکروليتر از آن در يک محيط LB Broth ديگر در کنار شعله کشت داده شد.
2. وقتي رشد باکتري به حدي رسيد که جذب آن در طول موج 600 نانومتر در حدود 0.4 -0.6 شد، کار مستعدسازي شروع گرديد.
3. سوسپانسيون باکتريايي حاصل به مدت 3 دقيقه با سرعت rmp9000 سانتريفوژ شده و رسوب باکتريائي حاصل بعد از خارجسازي کامل محيط رويي، مجدداً در 600 ميکروليتر محلول سرد CaCl2 (0.1 مولار) حل شد و با پيپت کردن به حالت سوسپانسيون در آمد. سپس سوسپانسيون سلولي 30 دقيقه در يخ قرار گرفت.
4. مجدداً سوسپانسيون سلولي 3 دقيقه با سرعت rmp9000 سانتريفوژ شد و بعد از خارجسازي کامل محلول رويي، مجدداً رسوب سلولي در 600 ميکروليتر محلول سرد CaCl2 (0.1 مولار) حل شد. سپس سوسپانسيون سلولي 30 دقيقه در يخ قرار گرفت.
5. سوسپانسيون فوق دوباره تحت همان شرايط سانتريفوژ شد. پس از خارجسازي محلول رويي رسوب در 200 ميکروليتر از محلول سرد CaCl2 (0.1 مولار) حل شد.
سلولهاي حاصل مستعد شده و براي انتقال DNA قابل استفاده بود. اين سلولها تا شروع مرحله بعدي در يخ قرار داده شد (Sarmbrook J,2008).
3-3- تراريختي يا انتقال وکتور حاوي ژن سنتتيک به درون سلول مستعد E.coli DH5?
1. 100 ميکروليتر از سلولهاي مستعد (که در يخ قرار داشتند)، به ميکروتيوپ يک و نيم ميليليتري استريل منتقل شد.
2. يک ميکروليتر از وکتور pGEM-B1 حاوي ژن سنتتيک به آن اضافه شد و مخلوط گرديد.
3. مخلوط فوق 30 دقيقه در يخ قرار گرفت.
4. سپس براي ايجاد شوک حرارتي، ميکروتيوپ به مدت 120-60 ثانيه در بنماري 42 درجه سانتيگراد و بلافاصله پنج دقيقه در يخ قرار گرفت.
5. به مخلوط ميکروتيوپ يک ميلي ليتر محيط LB Broth اتوکلاو شده اضافه شد.
6. سپس ميکروتيوپ يک ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتي گراد قرار گرفت.
7. سوسپانسيون سلولي در 9000 دور به مدت 3 دقيقه سانتريفوژ شده، از سوپرناتانت 800 ميکروليتر اوت شده و باقيمانده ابتدا سوسپانسيون شد و سپس در چهار پليتLB agar حاوي آمپيسيلين به طور مساوي کشت داده شد و يک شب در انکوباتور 37 درجه سانتيگراد قرار داده شد.
3-3-1- استخراج پلاسميد pGEM-B1 حاوي ژن سنتتيک dr2418-opti
پس از رشد کلنيها، چهار کلني در محيط LB Broth به حجم پنج ميليليتر حاوي آمپيسيلين کشت داده شد و يک شب در انکوباتور شيکردار 37 درجه سانتي گراد قرار داده شد. در ادامه محيط کشت حاوي باکتري به لولة اپندورف منتقل شده و سانتريفوژ گرديد. استخراجDNA پلاسميدي با کمک کيت استخراج پلاسميد ساخت کمپاني Roche آلمان طبق روش زير انجام شد:
1- به تيوب حاوي رسوب ميزان حجم µl250 بافر I اضافه شده، مخلوط کرده و به مدت پنج دقيقه در دماي اتاق (°C25-15) نگهداري شد.
2- به اين مخلوط، حجم µl350 از Binding buffer سرد حاوي RNase اضافه گرديده، مخلوط شده و سپس به مدت پنج دقيقه در يخ نگهداري گرديد.
3- سانتريفوژ در دماي °C10 در 14000 دور، براي ده دقيقه صورت گرفته سپس سوپ موجود در لايه رويي به تيوبهاي فيلتردار موجود در کيت منتقل گرديد.
4- سانتريفوژ مجدد به مدت 60-30 ثانيه انجام شده و سپس مايع زيرين فيلتر دور ريخته شد.
5- µl 500 از Washing buffer I سرد اضافه نموده و سانتريفوژ (13000 rpm, 1min) انجام شد.
6- مايع رويي دور ريخته شده، µl700 از Washing buffer II اضافه شده و سانتريفوژ تکرار شد.
7- سانتريفوژ براي خشک نمودن فيلتر حاوي ذرات پلاسميدي از مايعات اضافه تکرار شد.
8- فيلترها به تيوبهاي جديد موجود در کيت منتقل شد و سپس µl50 Elution buffer اضافه گرديده و بعد از گذشت پنج دقيقه در دماي اتاق سانتريفوژ (13000 rpm, 1min) تکرار شد. مايع زير فيلتر محتوي پلاسميد استخراج شده بود (Brown TA,2001).
3-3-2- تاييد استخراج پلاسميد حاوي ژن سنتتيک با روش آگارز ژل الکتروفورز
براي تاييد استخراج پلاسميد از روش آگارز ژل الکتروفورز استفاده شد. مولکولهاي DNA به دليل دارا بودن بار منفي در ميدان الکتريکي به سمت قطب مثبت حرکت ميکنند. بر اساس اين ويژگي، در ژل آگارز مولکولهاي سنگينتر کندتر و مولکولهاي سبک تر سريع تر حرکت مينمايند. الکتروفورز ژل آگارز در بافر 8TBE انجام ميگيرد. اين بافر نيروي يوني لازم براي هدايت الکتريکي را فراهم مي نمايد.
3-3-3- آماده سازي نمونهها براي الکتروفورز
براي ريختن نمونههاي DNA درون چاهک از رنگ بارگذاري استفاده ميشود که دو هدف را دنبال مي کند. از طرفي چگالي نمونه را افزايش ميدهد و از طرفي سبب انتقال کامل آن به درون چاهک ميشود، از طرف ديگر موجب رنگي شدن نمونه ميگردد.
3-3-4- رنگ آميزي DNA در ژل آگارز
بطور معمول از رنگ فلورسنتي به نام اتيديوم برومايد استفاده ميشود. اين ماده داراي عامل درج شونده9 بين بازهاي DNA ميباشد. وقتي در معرض امواج ماوراي بنفش قرار ميگيرد، اثر فلورسنتي خود را بروز داده و هرچه ميزان DNA بيشتر باشد، اثر فلورسنتي و ميزان طيف رنگي بيشتر خواهد بود (Sarmbrook J, 2008).
3-3-5- تهيه بافر TBE(10X)
براي تهيه 250 ميليليتر بافرTBE ، 25 گرم تريس باز بعلاوه 13.75 گرم بوريک اسيد و 10 ميليليتر EDTA 0.5 ميليمولار با pH:8 ، مخلوط شد و سپس حجم آن با آب مقطر دو بار تقطير به 250 ميليليتر رسيد. محلول حاضر 10X بود و براي مصرف بايد به صورت (1x) در آيد.
3-3-6- طرز تهيه ژل آگارز
درصد آگارز بکار رفته با توجه به اندازه DNA و عملي که قرار است انجام شود، متفاوت است. حجم مورد استفاده با توجه به اندازه قالب و قطر ژل مورد نظر تهيه ميشود که در اين پروژه بيشتر از ژل آگارز 8/0 % استفاده شد.
1. قالب ژل با طول و عرض مناسب، بسته به تعداد نمونهها انتخاب و آماده شد.
2. براي ايجاد چاهکها شانههايي با دندانههاي مناسب انتخاب و داخل قالب قرار ميگيرد، به طوري که دندانههاي شانه اندکي با سطح قالب فاصله داشته باشد.
3. پودر آگارز (با توجه به حجم ژل) پس از توزين، در مقدار مناسبي TBE(1X) حل و جوشانده شد.
4. پس از اينکه دماي محلول آگارز به 55 درجه سانتي گراد رسيد، به ازاي هر ده ميلي ليتر ژل يک ميکروليتر اتيديوم برومايد اضافه و پس از مخلوط شدن در قالب ريخته شد.
5. پس از اينکه ژل بطور کامل بسته شد، شانه را خارج و ژل در تانک الکتروفورز قرارگرفت.
6. براي هر چاهک 2 ميکروليتر رنگ بارگذاري با 4-3 ميکروليتر از نمونه DNA مخلوط و به درون چاهک منتقل شد.
7. بافر تانک (TBE-1X) بايد کاملاً روي ژل را بگيرد. تانک الکتروفورز به منبع تغذيه متصل شده و ولتاژ آن در حدود 80-70 ولت تنظيم شد.
8. وقتي رنگ نشانه سه چهارم طول ژل را طي کرد، ژل از تانک خارج و در دستگاه Gel Dock با نور UV نتيجه مشاهده و عکس برداري شد.
3-3-7- هضم آنزيمي وکتور pGEM/dr2418 توسط آنزيم Nde?
مواد مطابق جدول زير مواد به يک ميکروتيوپ افزوده شد و 4 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتيگراد قرار گرفت.
20 µl
pGEM/dr2418
2 µl
NdeI Enzyme
10 µl
Enzyme Buffer
68 µl
H2o
سپس محصول هضم آنزيمي ? به وسيله پروسه الکتروفورز ران شد. مراحل تخليص مطابق پروتکل روي محصول برش وکتور حاوي ژن سنتتيک انجام شد. سپس صحت آن بوسيله ران کردن در ژل الکتروفورز به اثبات رسيد.
3-3-8- هضم آنزيمي وکتور pGEM/dr2418 توسط آنزيم BamHI
در مرحله بعد هضم آنزيمي وکتور حاوي ژن سنتتيک توسط آنزي

منابع پایان نامه ارشد با موضوع سيتونمين، توليد، احياء

بررسي بيوسنتز و بيوشيمي MAA.پرداختند. در حالي که پيامدهاي مستقيم دارويي MAAاميدوار کننده به نظر مي رسد، به عنوان يک داروي پيشنهادي هنوز در دست بررسي مي باشد. علاوه بر MAA، استفاده از سيتونمين، ترکيب زرد رنگ مايل به قهوه اي و محلول در چربي از سيانوباکتري ها، به عنوان کرم هاي ضد آفتاب پيشنهاد شده است. سيتونمين يک آلکالوئيد ايندولي متقارن متشکل از واحدهاي هتروسيکليک ترکيبي بوده، که از طريق يک پيوند کربن-کربن (شکل 5) اتصال يافته اند. اين ساختار حلقهاي پيچيده و باند هاي دوگانه کونژوگه آن را به يک ترکيب پايدار تبديل نموده و شرايط را براي جذب پرتو فرابنفش فراهم مي آورد. تجزيه و تحليل اسپکتروفتومتري نشان داده است که غلاف سيتونمين در حفاظت سلول ها در برابر تابش فرابنفش ورودي موثر بوده اما نور قابل رويت نيست. مکانيزم القاء توليد سيتونمين به منظور بررسي پيامدهاي بيوتکنولوژي آن نيازمند شناسايي مي باشد. مطالعات متعدد نشان داده اند که دما و تنش هاي اکسيداتيو نوري به تنهايي سطوح سيتونمين را در سيانوباکتري ها افزايش نمي دهد (Dillon JG, 2010).
شکل 5: ساختار شيميايي سيتونمين
جدول 2: نقش دارويي اکستريموليت هاي جداسازي شده از اکستريموفيل هاي مقاوم به پرتو فرابنفش
با اين حال، ترکيبي از تابش UVA و تنشي که قبلاً ذکر شد به طور موثر قادر به افزايش سطح سيتونمين است. خشکي همراه با کمبود تثبيت نيتروژن و تابش UVA به عنوان آغازگر توليد سيتونمين در محيط کشت گزارش شده است. بيوسنتز سيتونمين توسط Souleو همکارانش مطالعه قرار گرفت، بر اين اساس مجموعه اي از 18 خوشه ژني (NpR1276 تا NpR1259)، در Nostoc punctiforme ATCC 29133.، توليد اين ترکيب را اداره مي کردند. در مدل پيشنهادي ژن هاي پايين دست ORF ژن NpR1273 (scyD)، آنزيمهاي مسير آمينو اسيدهاي آروماتيک را کد مي نمود. علاوه بر اين، تابش UVA قادر به القاء ژن هاي trp و typ بوده که منجر به توليد تريپتوفان و مونومرهاي فسفو هيدروکسي فنيل پيروات مي شوند که به احتمال زياد در بيوسنتز سيتونمين دخيل مي باشند. سيتونمين نيز به عنوان يک مهار کننده رقابتي ATP در کيناز هاي شبيه چوگان (PLK) بررسي شده است. از آنجا که PLK کنترل کننده ي بسياري از انکوژنها بوده، طي سالهاي طولاني به عنوان يک هدف در تحقيقات سرطان مد نظر قرار گرفته است (Soul T, 2009). Stevensonو هم کارانش نشان دادند سيتونمين قادر به مهار PLK1 در سنجش غربالگري فلش پليت و داراي توانايي درمان اختلالات پروليفراتيو بيش از حد ميباشند. در مطالعهي ديگر، سيتونمين به واسطه مهار PLK1 قادر به القاء آپوپتوز در استئوسارکوم و ديگر انواع سلول هاي سرطاني بوده، که اين نشان ميدهد سيتونمين ممکن است يک فارماکوفور جديد براي توسعه مهارکننده هاي پروتئين کيناز به عنوان داروهاي ضد تکثيري و ضد التهابي فراهم آورد. چندين ترکيب ديگر نيز از جمله اکتوئين، باکتريوروبرين، اسفاروفورين و پانارين پتانسيل دارويي خود را نشان داده اند.Buenger و Driller نشان دادند زماني که از اکتوئين استفاده شود، کراتينوسيتهاي انساني تحت تابش UVAاز آسيب محافظت ميشدند. اکتوئين همچنين نقش خود را در جلوگيري از آسيب ناشي از ليپوپليساکاريد باکتريايي، با بالا بردن سطح پروتئين HSP70. نشان داد. باکتريوروبرين جداسازي شده از Rubrobacter radiotolerans، ممکن است از کاربرد بالقوهاي در درمان انسان در ترميم رشته هاي آسيب ديده DNA ناشي از پرتوهاي يونيزان و جلوگيري از سرطان پوست داشته باشد. اسفاروفورين و پانارين جداسازي شده از گلسنگ ها، در ارتباط با توانايي خود در ترميم آسيب هاي DNA ناشي از راديکال هاي هيدروکسيل، نيتريک اکسيد، و آنيون سوپراکسيد مورد بررسي قرار گرفته اند. اکتوئين به طور گسترده اي براي توانايي خود در محافظت از پوست در برابر از دست دادن آب، خشکي، و آسيب هاي UV مورد مطالعه قرار گرفته است. مشخص شد که اکتوئين قادر به محافظت از پوست در برابر آسيب هاي ناشي از سديم دودسيل سولفات و از دست دادن آب و همچنين داراي اثر پروفيلاکسي مقابل پوست خشک بود (Buenger J, 2004). پيشنهاد شده است که مبناي اين مکانيسم توانايي اکتوئين در جلوگيري از سيستم هاي پيامبر ثانويه، فاکتور رونويسي AP-2، بيان مولکول 1 چسبندگي داخل سلولي، و جلوگيري از جهش DNA ي ميتوکندريايي مي باشد (شکل 6). علاوه بر اين، اثر اکتوئين به ويژه در سلول هاي لانگرهانس بيان ميشود، که اين امر موجب ارائه آنتي ژن هاي عبوري از سدهاي پوستي و القاء پاسخ ايمني سلول T مي شود. در مطالعه ي ديگر، معلوم شد اکتوئين يک نقش حفاظت از سلول را زماني بازي نمود که سلول ها در معرض ليپوپليساکاريد باکتريايي قرار گرفتند (Buommino E, 2005).
شکل 6: توليد سيتونمين در حضور تابش فرابنفش.
A. کاربرد سيتونمين در محصولات کرم هاي ضد آفتاب، جايي که سيتونمين تابش فرا بنفش را جذب نموده و در نتيجه سبب بقاي سلول مي گردد.
B. مسير فرضي که در آن سيتونمين PLK1 را مهار نموده و در نتيجه تنظيم پايين از مسيرهاي پشتيباني استرس و در نهايت منجر به نابودي سلول هاي سرطاني از طريق آپوپتوز مي گردد.
C. اکتوئين يک مسدود کننده چرخه سلولي و با جلوگيري از القاء پيامبران ثانويه، فعال سازي فاکتور رونويسي AP-2، و جهش DNA ميتوکندريايي و در نهايت منجر به پيشگيري از سرطان ناشي از تابش اشعه ماوراء بنفش يا ديگر شرايط سخت ديگر مي شود.
2-7-2- پيامدهاي بيوتکنولوژيکي اکستريموليت هاي مقاوم در برابر اشعه
علاوه بر پيامد هاي دارويي، مطالعات اخير، نقش مهمي در بسياري از کاربردهاي بيوتکنولوژيکي اکستريموليت هاي مقاوم به پرتو داشته است. کاربرد اکستريموفيل هاي مقاوم به پرتو در بخش انرژي زيستي به طور گسترده مطالعه نشده است. امروزه چالش کنوني يافتن يک فرآيند کارآمد و ارزان براي تخريب کربوهيدرات هاي پيچيده جهت توليد اتانول زيستي مي باشد.
بنا بر گزارش Gabaniو همکارانش دو سويه جداسازي شدهي جديدي از C. cellulans UVP1 و UVP4 B. pumilus به ترتيب قادر به زنده ماندن در حضور دوز هاي 1.03×106J/m2 و 1.71×105J/m2 از تابش UVC بودهاند. دو سويهي C. cellulans و B. pumilus توانايي هاي فوق العاده اي در تخريب سلولز تحت شرايط مختلف فيزيکي و شيميايي (دماي بالا، محتواي بالاي نمک و pH اسيدي) نشان دادند (Gobani P, 2012). اکستريموليتهاي مقاوم به پرتو نيز در پاکسازي زيستي زباله هاي هسته اي نقش دارد. مشخص گرديد آنزيم سيتوکروم C در Shewanella putrefaciens و Geobacter sulfurreducens در احياء راديو ايزوتوپ هاي اورانيوم محلول به گونه هاي نامحلول دخالت دارد. در Desulfovibrio desulfuricans ، مشاهده شد که يک هيدروژناز نيکل-آهن قادر به کاهش TC (VIII) بود. Fujimoto و Morita سويه اي جديد از Halomonas sp. را جداسازي نمودند که قادر به حذف تکنتيوم محلول از راه نامحلول ساختن آن بود. Kim و همکارانش نشان دادند Geobacter sp و ferrireducens Rhodoferax داراي پتانسيل متابوليک در احياء راديوايزوتوپ ها از طريق مکانيسم هاي آنزيمي مشابه با مواردي که در بالا بحث شد، ميباشند. بطور غير مستقيم احياء آنزيمي راديو نوکلوئيد ها به عنوان يک مسير در پاکسازي زيستي خاک آلوده به زباله هاي هسته اي حائز اهميت مي باشد. در اين فرآيند، احياء فلز و ميکروارگانيسم هاي احياء کنندهي سولفات، به طور غير مستقيم مي تواند در احياء راديو نوکلوئيد هاي محلول مورد استفاده قرار گيرد. در اين مکانيسم، اکسيداسيون ترکيبات آلي يا هيدروژن با احياء آهن(Fe+3) يا گوگرد (S+4) در فرم سولفات همراه است. اين محصولات مي تواند به گونه هاي چند جزئي نامحلول احياء گردد. براي مثال، باکتريهايي احياء کننده سولفات از جمله Micobacterium flavescens قادر به توليد ترکيباتي مثل اسيدهاي آلي، سيدروفورها و متابوليت هاي خارج سلولي همزمان با رشد در حضور U، Th، Am و Pu، مي باشند. علاوه بر احياء ترکيبات به فرم نامحلول، اين راديو نوکلوئيد ها مي توانند توسط اکستريموفيلهاي مقاوم به پرتو جذب گردند. جلبک دريايي قهوه ايCystoseira indica جذب موثري از راديوايزوتوپ اورانيوم را نشان داد. ساير ميکروارگانيسم ها نيز از جمله Citrobacter freudii و Firmicutes SP. جذب موثري از راديو نوکلوئيد ها را به نمايش مي گذارند. Wu و همکارانش روشي از پاکسازي زيستي غلظت هاي بالاي راديوايزوتوپ هاي اورانيوم را با افزودن اتانول را گسترش دادند (Wu WM, 2006).
ارگانيسم مقاوم به پرتو D. radiodurans داراي اثرات اثبات شده اي در تجزيه ي زيستي فلزات سنگين از آب هاي اسيدي و خنثي مي باشد. Misra و همکارانش پي بردند D. radiodurans قادر به حذف 70 درصد از mM 1 اورانيوم محلول ورودي مي باشد. علاوه بر فلزات سنگين، D. radiodurans در پاکسازي زيستي فتالات استري، که به طور گسترده اي در لوازم آرايشي، عطر و … استفاده مي شود، کاربرد دارد. اين توانايي D. radiodurans در تجزيه زيستي مي توان در بستر هاي ارگانيسم هاي مناسب مهندسي ژنتيک شده، گسترش يابد. بسياري از کاربرد هاي دارويي و صنعتي اکستريموليت ها و اکستريموزيم ها ثبت شده، که برخي از آنها در دهه گذشته صورت گرفته در جدول 2 خلاصه شده است. کمپاني Verenium تعداد نه اختراع ثبت شده مختلف در توسعه آنزيم هاي مقاوم به حرارت از طريق جهش زايي در ترموفيل ها را در اختيار دارد. اين امر شرايطي فراهم مي کند تا شرکت بتواند آنزيم هايي توليد کند که پايدار بوده و دو بار به عنوان آنزيم کارآمد در دماهاي بالا ( 60 ° C) مورد استفاده قرار گيرد. بيوتوپ AG با استفاده از روش تخمير پيوسته، در مقياس بزرگ براي برنامه هاي کاربردي مانند لوازم آرايشي و بهداشتي و دارويي، اکتوئين توليد مي نمايد. در يک کارآزمايي باليني انجام شده توسط بيوتوپAG ، مشخص شد که علائم رينيت آلرژيک حاد در بيماران به طور قابل توجهي با دريافت قطره چشم و اسپري هاي بيني اکتوئين، کاهش مي يابد (Liao CS.2010).
2-8- محدوديتها و چالشها در ديدگاه پنج ساله
توسعه داروهاي نسل جديد از جمله کرمهاي ضدآفتاب و متابوليتهاي ضدسرطان فاقد پتانسيل آلرژيزايي در انسان، اميدوار کننده است. از آنجا که متابوليت هاي اکستريموفيل ها به طور طبيعي از طريق تکامل انتخاب شده اند، اين ترکيبات سازگار با محيط زيست در نظر گرفته مي شوند. تحولات اخير در فن آوري هاي مبتني بر ژنوميکس، پروتئوميکس، و متابولوميکس مي تواند به بيوسنتز ميکروبي متابوليت هاي بالقوه با استفاده از ميکروارگانيسم هاي مهندسي ژنتيک شده در بيوراکتور ياري نمايد. چندين اکستريموليت و يا فرايندهاي توليد شده جهت استفاده در برنامه هاي کاربردي و لوازم آرايشي، بهداشتي و دارويي به ثبت رسيده است (Singh OV, 2011).
بسياري از ترکيبات MAA (به عنوان مثال، Helioguard 365 و Helionori) از اکستريموفيل ها در حال حاضر به عنوان محصولات ضد آفتاب براي حفاظت از تابش فرا بنفش با توجه به طيف جذب فرابنفش گسترده خود به صورت تجاري عرضه شده اند. علاوه بر اين، سيتونمين پتانسيلي دارد که به عنوان يک دارو در جلوگيري از آسيب هاي پوستي ناشي از تابش فرا بنفش، سرطان و التهاب عمل نمايد. با اين حال، به دليل فعاليت بيولوژيکي اين ترکيب به خوبي شناخته نشده است و نيازمند مطالعات بيشتر براي درک اثرات بالقوه آن در انسان مورد نياز است (Dela coba, 2007).
در نهايت، ملانين به طور گسترده اي در توليد کرمهاي ضد آفتاب محافظ نور استفاده مي شود، اما توليد رنگدانه هاي ملانين به دليل