منبع پایان نامه ارشد با موضوع بیوتکنولوژی

PCR (X10)
2
کلرید منیزیم (mM25)
6/0
dNTPs (mM10)
4/0
پرایمر F (mM25)
3
پرایمر R (mM25)
3
Taq DNA polymerase (units/µl5)
1/0
آب مقطر
به حجم 20 میکرولیتر

جدول 2-4 برنامه PCR گرادیان مربوط به ژن gcsf

2-7-2 کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا
به منظور کلون نمودن قطعه ژنی gcsf، این قطعه با برش آنزيمي از وکتور کلونینگ حامل قطعه (pGH-gcsf) جدا شده و در وکتور بیانی برش خورده با همان آنزیمها وارد گردید.

2-7-2-1 هضم آنزیمی وکتور pGH-gcsf
با توجه به جایگاههای برشی که در دو انتهای این قطعه (ژن gcsf) در نظر گرفته شد (جايگاه برش BamHI در انتهای ´5 و جایگاه‌ برش HpaI در انتهای ´۳)، این قطعه از وکتور مورد نظر (pGH-gcsf) بر اساس واکنش مندرج در جدول 2-5 در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 5 ساعت مورد هضم آنزیمی قرار گرفت.

مواد
مقدار (µl)
DNA الگو (وکتور pGH-gcsf) (1:10)
2
بافر PCR (X10)
2
کلرید منیزیم (mM25)
6/0
dNTPs (mM10)
4/0
پرایمر F (mM25)
3
پرایمر R (mM25)
3
Taq DNA polymerase (units/µl5)
1/0
آب مقطر
به حجم 20 میکرولیتر

جدول 2-5 واکنش هضم آنزیمی وکتور pGH-gcsf

2-7-2-2 هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan
وکتور pHan نیز با آنزیمهای BamHI و HpaI بر طبق جدول 2-6 مورد هضم آنزیمی قرار گرفت.

مواد
مقدار (µl)
DNA الگو (وکتور pGH-gcsf) (1:10)
2
بافر PCR (X10)
2
کلرید منیزیم (mM25)
6/0
dNTPs (mM10)
4/0
پرایمر F (mM25)
3
پرایمر R (mM25)
3
Taq DNA polymerase (units/µl5)
1/0
آب مقطر
به حجم 20 میکرولیتر

جدول 2-6 واکنش هضم آنزیمی وکتور pHan

2-7-2-3 کلون نمودن قطعه gcsf در وکتور بیانی pHan
واكنش لیگاسیون قطعات هضم و تخلیص شده پس از تعيين غلظت، بر طبق واکنش مندرج در جدول 2-7 انجام گرفت. تیوب ها به مدت 16 ساعت در یخچال قرار گرفته و پس از آماده سازی سلولهای مستعد از E. coli TOP10F’، به این سلولها منتقل شده و بر روی پلیت های حاوی آمپی سیلین و تتراسایکلین کشت داده شدند.

مقدار (µl)
مواد
واکنش اصلی
واکنش کنترل
وکتور pHan خطی شده (ng/µl100)
1
1
قطعه gcsf (ng/µl15)
16

بافر T4 DNA ligase (10X)
2
2
T4 DNA ligase (units/µl5)
1
1
آب دیونیزه

17

جدول 2-7 واکنش لیگاسیون ژن gcsf در وکتور بیانی pHan

کلنی های ظاهر شده بر روی پلیت ها، به صورت ماتریکس کشت داده شده و به مدت 16 ساعت در 37 درجه سانتی گراد گرماگذاری شدند.

2-7-2-4 بررسی کلون های نوترکیب pHan-gcsf
• بررسی کلون ها به روش سریع
مقداری از هر کلنی بر اساس پروتوکل موجود (2-6-6) آماده سازی شده و بر روی ژل آگارز برده شد. وکتورهای سنگین تر از وکتور بیانی pHan (بدون ژن الحاقی)، به عنوان وکتورهای مشکوک گزارش گردید.
• استخراج پلاسمید در مقیاس کم
از کلنی هایی که gcsf PCR آنها مثبت گردید، بر اساس پروتوکل2-6-8 به لوله های ml5 حاوی محیط LB مایع کشت داده و پس از گرماگذاری در °C37 به مدت 16 ساعت، استخراج پلاسمید در مقیاس کم انجام گردید.
• gcsf PCR بر روی پلاسمیدهای استخراج شده pHan-gcsf
پلاسمیدهای استخراج شده در واکنش PCR ژن gcsf بر اساس پروتوکل 2-7-1-1 وارد شده و محصول PCR بر روی ژل آگارز 1% برده شد.
• هضم آنزیمی وکتور تأیید شده pHan-gcsf
پلاسمید تأیید شده در مراحل قبل، مورد هضم آنزیمی با آنزیم های محدودالأثر BamHI، EcoRI و HpaI بر طبق جدول2-8 قرار گرفته و پس از گرماگذاری در C °37 به مدت 3 ساعت، محصول واکنشها بر روی ژل آگارز 1% برده شد.

مواد
مقدار (µl)
پلاسمید pHan-gcsf
2
بافر آنزیمی (10X)
2
آنزیم محدودالأثر (units/µl10)
75/0
آب دیونیزه
25/15

جدول 2-8 واکنش هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf

• استخراج پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf در مقیاس زیاد
پلاسمید تأیید شده با تست های فوق، بر اساس پروتوکل های2-6-9 منظور استفاده در مراحل بعدی، به مقیاس انبوه استخراج گردید.

2-7-3 کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf
2-7-3-1 PCR اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین (Sh ble)
در این تحقیق، به منظور غربالگری کلونهای هانسونلا بر آن شدیم تا ژن مقاومت به زئوسین (Sh ble) را در وکتور بیانی pHan که حاوی ژن gcsf می باشد کلون نماییم. برای این منظور، توالی این ژن در وکتور pPICZα (Invitrogen, USA) موجود در بخش بیوتکنولوژی بررسی گردید و پرایمرهای لازم جهت تکثیر این ژن طراحی گردید (جدول 2-9) و جهت سنتز سفارش داده شد. پس از دریافت پرایمرها، دمای بهینه برای تکثیر این ژن، به روش PCR گرادیان، در محدوده 65-50 درجه سانتی گراد (جدول2-10) بر طبق جدول 2-11 انجام شد.

پرایمر F
5′-gtagatcttgcggatccccc-3′
پرایمر R
5′-gtagatcttggtctccagcttgc-3′

جدول 2-9 پرایمرهای طراحی شده جهت تکثیر ژن zeocin

تعداد چرخه
مدت زمان (دقیقه)
دما (°C)
واسرشتی اولیه
1
‘5
˚94
واسرشتی
اتصال پرایمرها
طویل شدن

35
‘1
“30
“30
˚94
60-50
˚72
طویل شدن نهایی
1
‘5
˚72

جدول 2-10 برنامه PCR گرادیان ژن zeocin

مواد
مقدار (µl)
DNA الگو (پلاسمید pPICZα) (1:10)
2
بافر PCR (X10)
2
کلرید منیزیم (mM25)
6/0
dNTPs (mM10)
4/0
پرایمر F (mM25)
3
پرایمر R (mM25)
3
Taq DNA polymerase (units/µl5)
1/0
آب مقطر
به حجم 20 میکرولیتر

جدول 2-11 مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش zeocin PCR

2-7-3-2 کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy
قطعه تکثیر شده zeocin با استفاده از کیت از ژل آگارز بر اساس پروتوکل 2-6-2 استخراج شده و پس از تعيين غلظت،واکنش لیگاسیون آن در وکتور کلونینگ pGEM بر طبق جدول 2-12 صورت گرفت.

مقدار (µl)
مواد
واکنش اصلی
واکنش کنترل
وکتور pGEM-T Easy خطی (ng/µl50)
1
1
ژن zeocin (ng/µl50)
2

بافر T4 DNA ligase (X4)
5
5
T4 DNA ligase (units/µl5)
1
1
آب دیونیزه
11
13

جدول 2-12 واکنش لیگاسیون ژن zeocin در وکتور pGEM-T Easy

واکنشهای فوق به صورت ON در دمايC ˚4 قرار داده شدند و پس از تهیه سلولهای مستعد از سلولهای ‘ E. coli TOP10F ، به این سلول ها منتقل شده و بر روی محیط LB آگار با غلظت پایین NaCl (پیوست 1) و حاوی زئوسین، تتراسایکلین، IPTG و X-gal (پیوست 5) کشت داده شد. پس از گرماگذاری در 37 درجه به مدت 16 ساعت، کلنی های سفید تشکیل شده، بر روی پلیت ماتریکس حاوی ترکیبات فوق کشت داده شدند.

2-7-3-3 بررسی کلونهای نوترکیب pGEM-Zeocin
• بررسی سریع کلونهای نوترکیب
70% هر یک از کلنی های سفید به روش quick check (پروتوکل 2-6-6) مورد بررسی قرار گرفت.
• استخراج پلاسمید pGEM-Zeo در مقیاس کم
از کلون نوترکیب تأیید شده با دو روش قبل، استخراج پلاسمید در مقیاس کم (2-6-8) انجام گردید.
• هضم آنزيمي وکتور pGEM-Zeo
هضم آنزیمی وکتور تأیید شده از مراحل قبل با آنزیم BglII به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد بر اساس جدول 2-13 صورت گرفت.

مواد
مقدار (µl)
پلاسمید pGEM-Zeo
2
بافر آنزیمی (X10)
2
BglII (units/µl10)
5/0
آب دیونیزه
5/15

جدول 2-13 واکنش هضم آنزیمی pGEM-Zeo با BglII

2-7-4 کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf
2-7-4-1 هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf و pGEM-zeo
برای کلون نمودن قطعه ژنی مقاومت به زئوسین در وکتور pHan-gcsf، این دو وکتور با آنزیم BglII که جایگاه برش آن در دو انتهای قطعه ژنی زئوسین و نیز بر روی وکتور pHan-gcsf در نظر گرفته شده بود، مورد هضم آنزیمی قرار گرفتند (جدول 2-14).

مواد
مقدار (µl)
پلاسمید
20
بافر آنزیمی (X10)
20
BglII (units/µl10)
5
آب دیونیزه
155

جدول 2-14 واکنش هضم آنزیمی pGEM-zeo و pHan-gcsf با BglII

وکتور pHan-gcsf هضم و تخلیص شده، بر اساس جدول 2-15 به مدت 1 ساعت در 37 درجه سانتی گراد تحت تیمار با آلکالین فسفاتاز قرار گرفت.

مواد
مقدار (µl)
پلاسمید pHan-gcsf
60
بافر آنزیمی (X10)
8
آنزیم آلکالین فسفاتاز (units/µl10)
2
آب دیونیزه

جدول 2-15 تیمار وکتور هضم شده pHan-gcsf با آلکالین فسفاتاز

2-7-4-2 کلون نمودن قطعه ژنی zeocin در وکتور بیانی pHan-gcsf
پس از هضم آنزیمی، قطعه مورد نظر (ژن مقاومت به زئوسین، حدوداً bp1100( از روی ژل جدا شده و پس از تخلیص با کیت، بر طبق واکنشهای لیگاسیون جدول 2-16 در درون وکتور بیانی pHan-gcsf تیمار شده با آلکالین فسفاتاز کلون گردید.

مقدار (µl)
مواد
واکنش اصلی
واکنش کنترل
وکتور pHan-gcsf خطی شده (ng/µl100)
5/1
5/1
قطعه zeocin (ng/µl15)
25

بافر T4 DNA ligase (X2)
3
3
T4 DNA ligase (units/µl5)
1
1
آب دیونیزه

5/24

جدول 2-16 واکنش لیگاسیون ژن zeocin در وکتور بیانی pHan-gcsf
واکنش‌های فوق به صورتON در دماي C˚4 قرار داده شدند و روز بعد پس از تهیه سلولهای مستعد از E. coli TOP10F’ به این سلولها منتقل شده و بر روی پلیت های LB آگار با غلظت پایین NaCl و حاوی زئوسین با غلظت µg/ml25 کشت داده شدند. پس از گذشت 16 ساعت در دمای C˚37، از کلنی های رشد یافته، پلیت ماتریکس تهیه گردید.

2-7-4-3 بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin
• بررسی سریع کلونهای نوترکیب
کلونهای رشد یافته بر روی پلیت حاوی زئوسین به منظور بررسی الحاق قطعه ژنی مقاومت به زئوسین بر روی ژل آگارز برده شدند.
• بررسی کلونها به روش Colony-PCR
کلونهایی که با روش سریع سنگینتر تشخیص داده شدند، برای انجام PCR اختصاصی ژن زئوسین مورد استفاده قرار گرفتند.
• برش آنزيمي وکتور نوترکیب pHan-gcsf-zeocin
به منظور تأیید نهایی وكتور نوترکیب فوق، با توجه به سایت‌های برشی موجود، وكتور بر اساس جدول 2-17 با آنزيم BglII برش داده شد. مخلوط این واكنش به مدت 3 ساعت در دماي C˚37 گرماگذاری شد و سپس بر روی ژل 1% برده شد.

مواد
مقدار (µl)
پلاسمید pHan-gcsf-zeocin
3
بافر آنزیمی (X10)
2
BglII (units/µl10)
5/0
آب دیونیزه
5/14

جدول 2-17 واکنش هضم آنزیمی pHan-gcsf-zeocin با BglII

2-7-5 انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا
2-7-5-1 هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin
پس از اطمینان از قرار گرفتن ژنهای مورد نظر در پلاسمید هانسونلا، انتقال این پلاسمید به درون میزبان مخمری (هانسونلا پلی مورفا) با روش الکتروپوریشن صورت گرفت. برای این منظور، به مولکول DNA خطی شده با غلظت بالا نیاز می باشد. برای تهیه DNA خطی، وکتور نوترکیب تأیید شده در مراحل قبل با آنزیم EcoRI بر طبق جدول 2-18 مورد هضم آنزیمی قرار گرفته و پس از استخراج از ژل، در پروسه الکتروپوریشن مورد استفاده قرار گرفت.

مواد
مقدار (µl)
پلاسمید pHan-gcsf-zeocin
15
بافر آنزیمی (X1)
20
EcoRI (units/µl10)
5
آب دیونیزه
160

جدول 2-18 واکنش هض
م آنزیمی pHan-gcsf-zeocin با EcoRI

2-7-5-2 الکتروپوریشن سلول های هانسونلا پلی مورفا
1. ابتدا میزان مناسبی از کلنی تازه رشد یافته مخمر را به درون ml200 محیط کشت مایع YPD تلقیح نموده و محیط را بر روی شیکر در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد گرماگذاری میکنیم تا جذب نوری محیط در طول موج 600 نانومتر (OD600nm) به 2/1-8/0 برسد.
2. محیط کشت فوق را در rpm5000 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ نموده و به میزان 2/0 برابر، بافر فسفات پتاسیم mM50 ولرم (C°37( با 5/7pH و سپس DTT 1مولار با غلظت نهایی mM25 به آن اضافه نمایید.
3. سلولها را به مدت 15 دقیقه در دمای C°37 قرار می دهیم.
4. سلول ها را با سانتریفوژ در rpm5000 به مدت 5 دقیقه جمع آوری نموده و دو بار با بافر STM (پیوست 7) درحالیکه سلولها بر روی یخ قرار دارند شستشو می دهیم (بار اول به صورت هم حجم و در مرحله دوم با نصف حجم اولیه).
5. رسوب سلولی نهایی را در 005/0 حجم اولیه از بافر STM حل کرده و این سوسپانسیون سلولی مستعد را در حجم های کم در دمای C°70- نگهداری میکنیم.
6. به منظور ترانسفورم نمودن سلولهای مستعد، سوسپانسیون های سلولی (حجم µl60) را بر روی یخ ذوب نموده و µg10- ng200 از مولکول DNA خطی شده را به آن اضافه میکنیم.
7. سپس سلولها به کووت الکتروپوریشن 2 میلی متری سرد منتقل می شوند.
8. بعد از خشک نمودن کووت آن را درون دستگاه الکتروپوریشن قرار داده و به آن پالسی با مشخصات 2 کیلوولت، 25 میکروفاراد و 200 اهم وارد مینماییم.
9. بلافاصله پس از وارد نمودن پالس، ml1 محیط کشت YPD به تیوب حاوی سلولها اضافه کرده و به مدت 1ساعت در دمای °C 37 در شیکر انکوباتور قرار می دهیم.
10. محیط را سانتریفوژ نموده (rpm5000, 5دقیقه( و سلولها را بر روی محیط کشت YPD جامد حاوی زئوسین با غلظت µg/ml400 کشت داده و به مدت 5-3 روز در دمای °C37 قرار میدهیم.
11. سلولهای رشد یافته در غلظت بالای زئوسین (µg/ml400)، به صورت ماتریکس بر روی پلیت حاوی 800 و سپس µg/ml1600 کشت داده شدند.
12. پس از گذشت مدت زمان لازم (3 روز) از کلونهای رشد یافته برای انجام PCR اختصاصی ژنهای کلون شده در وکتور بیانی استفاده گردید.

2-7-5-3 تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony PCR اختصاصی ژن زئوسین
PCR اختصاصی ژن زئوسین بر روی کلونهای نوترکیب رشد یافته در مراحل قبل بر اساس پروتوکل 2-7-3-1 و جدول 2-13 انجام گردید.

2-7-6 بیان پروتئینGCSF در هانسونلا پلی مورفا
2-7-6-1 کشت سلولهای مخمری
1. سلول مخمری تأیید شده با PCR ژن زئوسین و نیز سلول مخمری فاقد پلاسمید در ml5 محیط کشت BMGY (پیوست 1) کشت داده

این نوشته در پایان نامه ها و مقالات ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *