منابع پایان نامه ارشد با موضوع ترميم، پروتئين، باکتري

اما فورمات و H2O توليد ميشود (شکل 1).
شکل 1. مسيرهاي سميت زدايي سوپراکسيد اکسيژن در (A) هوازي ها و ارگانيسم هاي بي هوازي (B و C). Cyt bd: سيتوکروم bd يوبي کوئينول اکسيداز. Prx: پروکسي ردوکسين، rd: روبردوگسين، SOD: سوپراکسيد
ديسموتاز، SOR: سوپراکسيد ردوکتاز، NROR: NAD(P)H روبردوکسين اکسي ردوکتاز.
در اين تحقيق در نظر است پروتئين DR2418 به صورت نوترکيب تهيه تا در تحقيقات آتي از آن استفاده شود.
به طور خلاصه اهدف اين تحقيق به شرح زير است:
_ با توجه به اينکه ژنهاي ايجادکننده مقاومت به اشعه در باکتري Deinococcus radiodurans وجود دارد، مي توان عملکرد اين ژنها را در مقياس آزمايشگاهي بررسي نمود. بنابراين هدف از اين مطالعه، تهية پروتئيني بود که در مقاومت باکتري نسبت به پرتو نقش دارد. در تحقيقات آتي ميتوان از آن براي تهية مواد ضدپرتو استفاده نمود.
_ کلون کردن ژن dr2418 در وکتور pGEM وساب کلون کردن آن در وکتور بياني pET21
_ بررسي ميزان بيان پروتئين DR2418 در ميزبان E.coli origami
_ خالصسازي پروتئين نوترکيب DR2418 به روش کروماتوگرافي
فصل دوم:
مروري بر تحقيقات انجام شده
پيشينه تحقيق:
يکي از شگفت انگيز ترين ارگانيسم هاي کشف شده تا به امروز Deinococcus radiodurans مي باشد. اين باکتري در سال 1956 توسط Artthur W. Anderson کشف شد. در حاليکه آرتور براي استريل کردن کنسروهاي گوشت از اشعه گاما استفاده کرده بود بعد از مدتي متوجه فساد گوشت کنسرو شده شد و تنها ميکرو ارگانيسمي که توانست از گوشت جدا کند Deinococcus radiodurans بود.ژنوم اين باکتري در سال 1999 توسط Tiger A توالي يابي شد و تحليل و بررسي دقيق ژنوم باکتري در سال 2001 به پايان رسيد.
Deinococcus radiodurans توانائي هاي مختلفي در جلوگيري از آسيب هاي اشعه راديو اکتيو و همچنين ترميم DNA تک رشته اي خود دارد. D.radiodurans يک باکتري نسبتا بزرگ ، کروي است که معمولا 4 سلول به هم متصل شده و تشکيل تتراد مي دهند.
در مطالعه انجام شده توسط WANG LiangYan و همکارانش در سال 2012 نشان داده شد که بيان همزمان PprI و DR2418 در سلول E. coli حفاظت بخشي عليه اشعه گاما و ترميم DNA را افزايش مي دهد بطوريکه موتانت هاي فاقد اين دو ژن بسيار حساس تر به اشعه گاما هستند. هم چنين موتانت هاي فاقد PprI و DR2418، در دو ژن recA و PprA کاهش بيان دارند و در بازآرايي ژنوم نقص دارند و مقاومت آن ها به اشعه کاهش مي يابد. علاوه بر اين، نتايج اين مطالعه نشان داد که حذف ژني PprI در سويه هاي وحشي اشعه ديده باعث کاهش بيان DR2418 مي شود. بنابراين، توليد پروتئين PprI بيان drRRA را تحت تاثير قرار مي دهد. هم چنين يک پروتئين جديد به نام PprM (Cold shock protein) در پاسخ به اشعه نقش دارد که توسط ژن PprI کنترل مي شود (WANG L, 2012).
Duohong Sheng و همکارانش در سال 2005 نشان دادند که پروتئين RecX در باکتري داينوکوکوس به عنوان يک رپرسور براي بيان recA عمل مي کند و افزايش بيان RecX مقاومت پذيري سلول را براي اشعه گاما کاهش مي دهد. هم چنين نتايج اين مطالعه نشان داد که RecX در باکتري داينوکوکوس فعاليت آنتي اکسيدانتي را مهار مي کند (Jong ll K, 2009). Tian و همکاران در گزارش خود الکتروفورز دو بعدي انجام دادند که توانستند در بين ده سويه وحشي داينوکوکوس يک سويه با باند پروتئيني متفاوت، که پروتئين DR2418 ناميده شد، شناسايي کنند.
در مطالعات قبلي نشان داده شده است که متابوليسم آنتي اکسيدانتي در باکتري هاي مقاوم به اشعه نقش بسيار مهمي دارد. مطالعات نشان مي دهد که پروتئين DR2418 در باکتري D. radiodurans مي تواند بطور قابل توجهي بيان ژن هاي recA و pprA را القا کند و فعاليت آنزيماتيک کاتالاز را در اين باکتري افزايش دهد. موتانت هاي DR2418 به اشعه گاما بسيار حساس هستند و قابليت سلول براي جلوگيري از آسيب هاي ناشي از راديکال هاي آزاد بطور قابل توجهي کاهش مي يابد (P.R.Bianco, 1998). پروتئين recA نقش بسيار حساس در نوترکيبي هومولوگ و تنظيم سيستم ترميمي SOS دارد که نقش شکست پروتئوليتيکي رپرسور LexA در باکتري E. coli دارد که منجر به فعال سازي رگولون SOS مي شود. ژن recA در باسيلوس سوبتيليس توسط رونويسي فاکتور ComK فعال مي شود که براي از بين بردن LexA لازم است. recA در D. radiodurans مقاوم به اشعه شباهت هاي عملکردي با recA در باکتري E. coli و باسيلوس سوبتيليس دارد که از نظر توالي اسيدآمينه اي همانند هم هستند. سويه هاي موتانت recA نسبت به سويه هاي وحشي بسيار حساس به اشعه هستند. پروتئين DR2418 فقط در D. radiodurans وجود دارد و در ساير سويه ها و باکتري هاي مقاوم به پرتو وجود ندارد. راديکال هاي اکسيژن و هيدروژن پرکسيد از شکست مولکول هاي آب توسط اشعه بوجود مي آيد که منجر به آسيب به غشاي سلولي، DNA و پروتئين مي شود (C.Bonacossa, 2002). در مطالعات نشان داده شده است که سويه هاي E. coli حاوي ژن dr2418 داراي فعاليت نسبي بيشتر در از بين بردن راديکال هاي سمي اکسيژن هستند. مکانيسم دفاعي معمول در سلول عليه O2•- و H2O2 توسط آنزيم هاي داراي فعاليت آنتي اکسيداني سوپراکسيد ديسموتاز و کاتالاز انجام مي گيرد. بيان ژن PprI در E. coli منجربه افزايش بيان KatG مي شود که با افزايش دوز اشعه گاما ميزان بيان KatG افزايش مي يابد (Ohba H,2009).
در مطالعه اي که توسط Huiming Lu و همکاران در سال 2009 صورت گرفت نقش پروتئين Ppr1 و نقش تنظيمي آن بعد از قرار گرفتن باکتري Deinococcus radiodurans در معرض تابش شديد اشعه مشخص شد. آن مطالعه بر اساس مقايسه بين سويه وحشي R1 و سويه اي که ژن Ppr1 آن حذف شده بود صورت گرفت و مشخص شد در سويه وحشي يک سري از ژن ها به دنبال Ppr1 بيان شده و فعاليت هاي مختلفي از جمله رونويسي ، متابوليسم ، و ترميم به صورت کامل تر و متفاوت با سويه فاقد ژن Ppr1 پيش مي رود و سويه وحشي توانايي بالاتري در مقايسه با سويه فاقد ژن Ppr1 در مواجهه با اشعه راديو اکتيو دارد.(Huiming Lu, 2009).
2-1- ترميم شکستگيهاي DNA دورشتهاي:
شکست هاي DNA دورشته اي بسيار خطرناک بوده و بايد ترميم گردد. با اين حال، باکتري D .radiodurans و آرکي T. gammatolerans ميتوانند دوزهايي از اشعه گاما را تحميل شوند که هزاران شکست در طول DNA دورشتهاي و در طول ژنوم ايجاد مي کند. پروتئين هاي مختلفي در ترميم DNA دخيل هستند. سنتيک ترميم شکستگي DNA دورشته اي در D .radiodurans بعد از مواجه شدن با 6800 Gy اشعه گاما خيلي سريع است و هنگامي که سلول ها بعد از مواجه شدن با اشعه در محيط کشت غني قرار مي گيرند بعد از دو تا سه ساعت خود را ترميم مي کند (Krisko A , 2013) (شکل 2).
شکل 2. سينتيک ترميم ژنوم D .radiodurans و T. gammatolerans بعد از اينکه در معرض اشعه گاما قرار مي گيرند. D .radiodurans و T. gammatolerans در طي فاز رشد لگاريتمي به ترتيب در دوزهاي 6800 Gy يا 5000 Gy اشعه گاما قرار گرفتند و سپس در محيط کشت غني شده در دماي 30 درجه سانتي گراد براي D. radiodurans و 85 درجه سانتي گراد براي T. gammatolerans جهت ترميم خود قرار گرفتند. جهت جلوگيري از شکست مکانيکي DNA در آزمايشگاه سلول ها محبوس شدند و با آنزيم محدودالاثر بريده شدند.
2-2- مکانيسم ترميم شکستگي DNA دورشته اي:
چندين مکانيسم براي ترميم موثر DNA دورشته اي نشان داده شده است. جهت ترميم DNA توسط روش نوترکيبي هومولوگ، متصل شدن تک رشته اي (SSA) يا سنتز رشته ها وابسته به چسبيدن رشته (ESDSA)، سلول ها نياز به يک کپي کامل ديگر از DNAآسيب ديده باشند. بر خلاف آن، اتصال انتهايي غيرهومولوگ (NHEJ) به کپي دوم از DNA جهت اتصال رشته هاي کانتيگ نياز ندارند (Hefferin ML, 2005).
2-2-1- نوترکيبي هومولوگ (HR):
مسير اصلي در ترميم شکست DNA در باکتري ها و مخمر ساکاروميسس سرويزيه است. HR از DNA هومولوگ کامل براي ترميم توالي هاي آسيب ديده DNA استفاده مي کند. اولين مرحله ترميم DNA دورشته اي توسط روش نوترکيبي هومولوگ، پردازش انتهاي DNA براي بوجود آوردن DNA تک رشته اي آويز وجود دارد که RecA در باکتري ها و RadA در آرکي ها و Rad51 در سلول هاي يوکاريوتي براي تشکيل رشته هاي نوکلئوپروتئين فراخواني مي شوند. مرحله بعدي HR تعويض رشته هاي DNA است (Setiz EM, 1998).
شکل 3. مسيرهاي مختلف ترميم DNA دورشته اي
2-2-2- اتصال تک رشته (SSA):
علاوه بر نوترکيبي هومولوگ، SSA نشان داده شده است در سلول هاي اشعه ديده داينوکوک اتفاق مي افتد، بطوريکه شکست DNA دورشته اي ترميم مي شود. فرايند SSA مي تواند اتفاق بيافتد اگر دورشته DNA آسيب ديده در يک منطقه از کروموزوم وجود داشته باشند. بعد از واکنش انجام شده توسط اگزونوکلئاز، DNA آويز شده تک رشته اي ايجاد مي شود. اگر DNA آويز شده داراي توالي هاي مکمل باشد، آنها مي توانند به هم متصل شوند. سپس، منطقه تک رشته اي موجود در کروموزوم دوباره ساخته شده توسط سنتز DNA پر مي شود.
2-2-3- سنتز Extended وابسته به اتصال رشته ها (ESDSA):
Zharadka و همکارانش در سال 2006 يک مدل از SSA به نام ESDSA پيشنهاد کردند، بر طبق اين مدل، انتهاي تک رشته يک قطعه به قطعه هم پوشان حمله مي کند و سنتز DNA آغاز مي شود. با اين حال، بر خلاف آنچه که در همانندسازي کلاسيک DNA مي شود، قطعات تک رشته اي تازه سنتز شده DNA توسط جابجاشدگي D-loop ايجاد مي شود. اگر انتهاي قطعات DNA تک رشته اي تازه شنتز شده مکمل هم باشند مي توانند به هم متصل شوند و تشکيل DNA دورشته اي بلند تسهيل مي شود که در نهايت اين رشته ها به هم متصل شده و DNA حلقوي را ايجاد مي کند (Zahra dka K, 2006).
اغلب تغييرات بحراني و خشن در محيط سلول ها، يك سري از ژن ها را كه محصول پروتئيني آنها از سلول حفاظت مي كند، فعال و بيان ميکند. اين محصولات باعث كاهش اثرات بحراني و خشن در سلول مي شوند. يکي از مکانيسم ها که در بين همه سلول ها ديده شده است، مکانيسم Heat shock response است. معمولا در مواردي كه سلول در تغييرات دماي بالا قرار گرفته است. پروتئين هاي heat shook پايداري و ترميم پروتئين هايي از سلول كه تا قسمتي دناتوره شده اند را باعث مي شوند. سلول ها همچنين داراي مكانيزم هايي هستند كه سطح آنزيم هاي ترميم DNA را مثل يك حالت اورژانسي در پاسخ به آسيب ديدگي DNA بالا مي برد. بهترين مورد مطالعه شده در E. coli گزارش شده است . اين سيستم به نام پاسخ SOS خوانده مي شود . هر عاملي كه جلوي سنتز مولكول DNA را بگيرد و باعث آسيب به دو رشته اي DNA گردد يك سيگنال القايي براي افزايش نسخه برداري بيشتر از ?? ژن را پديد مي آورد كه بيشتر اين ?? ژن براي بيان پروتئين هايي هستند كه در ترميم DNA نقش دارند . اين سيگنال القايي به نظر مي رسد حضور DNA تك رشته اي است كه در ابتدا پروتئين RecA را فعال مي كند. پروتئين RecA قادر است مهار كننده نسخه برداري يك سري بزرگ از ژن ها را تخريب كند و در نتيجه پاسخ SOS از اين جا آغاز مي گردد ولي در كنار آن جهش هم وجود دارد كه به آن Error prone مي گويند. سلول ها هم چنين يك مكانيسم ديگر براي كمك به پاسخ ترميمي مولكول DNA دارند. آنها از پيشرفت سيكل مولكولي جلوگيري مي كنند تا زماني كه ترميم DNA كامل شود . پروتئين SalA يكي از پروتئين هاي حاصل پاسخ SOS است كه از پيشرفت تقسيم سلولي جلوگيري مي كن

این نوشته در No category ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *