منابع و ماخذ پایان نامه پليمراز، توالي، دماي

دانلود پایان نامه

درون جمعيتها استفاده ميشوند (12). ريزماهوارهها به دليل همبارز بودن و تبعيت از توراث مندلي و تشخيص آسان افراد هموزيگوس از هتروزيگوسي در بررسي تنوع ژنتيکي و انتخاب والدين برتر استفاده ميشوند (56). نشانگر SSR به دليل همبارز بودن و سطح بالاي چندشکلي و کاربرد آسان اين تکنيک، يک روش مناسب براي بررسي تنوع ژنتيکي به حساب ميآيد(18).
1-12-3-2-4 نشانگرISSR24:
زيتکيويز و همکاران در سال 1994 نشانگر مولکولي جديدي (مبتني بر PCR) به نام ISSR را معرفي کردند(76). اين تکنيک شامل تکثير قطعات DNA موجود در فواصل قابل تکثير بين دو توالي تکراري ريزماهواره است که در دو جهت مختلف آرايش يافتهاند. در اين نشانگرها معمولاً از ريز ماهوارههايي با طول 25-16 جفت باز به عنوان آغازگرهايي که در يک واکنش PCR مکانهاي ژنومي زيادي را مورد هدف قرار ميدهند استفاده ميکنند و به دليل طويل بودن آغازگرها، تکرارپذيري بالايي دارند، همچنين طول قطعات تکثيري با هم متفاوت ميباشند. تکرارهاي ريزماهواره که به عنوان آغازگر استفاده ميشوند، اصولاً دو، سه، چهار يا پنج نوکلئوتيدي ميباشند. اين آغازگرها مي توانند بدون باز اضافه (55،33و25) يا داراي 1 تا 4 باز اضافي به صورت لنگر در انتهاي ´3 يا ´5 باشند (76). نشانگرISSR تصادفي بوده و تکرارپذيري و چندشکلي بالايي دارد و در طيف وسيع از گياهان استفاده ميشود. ميزان تکرارپذيري در نشانگر ISSR بين 95-92 درصد است. بخصوص زماني که از ژل پلياکريلآميد استفاده گردد. اين تکنيک نيازمند اطلاعات اوليه در مورد توالي ژنوم نيست و الگوي چندشکلي زياد و چند لوکوسي ايجاد مينمايد. ميزان DNA مورد استفاده در اين تکنيک بسته به نوع گياه متفاوت و در حدود 10 تا50 نانوگرم ميباشد (43). نشانگرهاي ISSR، اغلب به عنوان نشانگرهاي غالب معرفي ميشوند که از قوانين توارث مندلي تبعيت ميکنند (66،56 و 25).
1-12-3-2-5 نشانگرSRAP25:
لي و کويروس در سال 2001 براي اولين بار نشانگر مولکولي جديدي به نام SRAP را معرفي کردند(34). SRAP، تکنيک نشانگر تقريبا جديدي است که توالي کددهنده ژنوم را توسط پرايمرهاي 17 تا 19 نوکلئوتيدي هدفگيري مي کند (40) که به خصوص براي تکثير توالي (Open Reading Frame) ORF مورد استفاده قرار ميگيرد و بر مبناي 2 پرايمر تکثيرکننده ميباشد (55) . اين سيستم نشانگر حتي قابليت تشخيص ميزان بالائي از پليمورفيسم را نيز در بين گونهها دارد (47).
مارکرهاي SRAP تمام ويژگيهاي يک مارکر مولکولي مناسب را از قبيل همبارز بودن دارد يعني مي تواند هوموزيگوتها را از هتروزيگوت ها تشخيص دهد (35). پرايمر forword داراي 17 جفت نوکلوئيد است که 14 نوکلوئيد آن ثابت و غني ازG,C است و3 نوکلئوتيد متغير آن در انتهاي /3 قرار دارد. اين پرايمر ترجيحا ناحيه اگزون را تقويت ميکند (ناحيه اگزون غني از G,C است). پرايمر Reverse داراي 19 جفت نوکلئوتيد است که 16 نوکلئوتيد آن ثابت و غني ازA,T است و3 نوکلئوتيد متغير آن در انتهاي /3 قرار دارد. اين پرايمر ترجيحا ناحيه اينترونها وپروموتورها را تقويت ميکند (35). پلي مورفيسم اساساً از تنوع طول اين اينترونها وپروموتورها و فاصلهها، ايجاد ميشود. 3 نوکلئوتيد متغير انتهايي SRAP ميتواند بر طبق طراحي ترکيبات مختلف پرايمري تغيير کنند. جفت پرايمرها ميتوانند با ترکيب پرايمر forword و reverse ترکيبات جديدي را ايجاد کنند که هزينه سنتز پرايمرها را کاهش ميدهد و استفاده از پرايمرهاي موثر را افزايش ميدهد (شکل1-4).
Ferriol و همکاران گزارش دادند نشانگر SRAPبيشترين هماهنگي را با تغييرات مورفولوژي نسبت به ساير نشانگرها دارد. زيرا SRAPباعث تکثير توالي ORFs(قالب خواندني باز) ميشود که در واقع اين توالي هدف در ارتباط مستقيم با بروز صفات مورفولوژيکي در موجودات ميباشند. Budakو همکاران (2004). چهار نشانگر درbuffalograss براساس قدرت تنوع ژنتيکي مقايسه کردند(71،36،43و35).
SRAP SSR ISSR RAPD
شکل 1-4 نحوه اتصال پرايمرهاي forwad و reverse به DNA الگو
مزاياي نشانگر SRAP:
سهولت و آساني
تکرارپذيري (قابليت تکثير) بالا
سرعت عملکرد مناسب
جداسازي آسان باندها براي تعيين توالي
شناسايي و تکثير نواحي هدف( نواحي ORFs)
داشتن پليمورفيسم بالا
معايب نشانگر SRAP:
همبارز نبودن
1-13 کاربرد مارکرهاي DNA :
1-توالييابي ژنوم: شايد مهمترين کاربرد مارکرها باشد. از آنجا که ژنوم يوکاريوتها خيلي بزرگ است براي توالييابي آن بايد ژنوم را به قطعات خيلي کوچک تقسيم کرد و هر قطعه را جداگانه توالييابي نمود. لذا بايد روي DNA نقاط معياري وجود داشته باشد تا بتوان براساس آنها نتايج حاصل از توالييابي قطعات را کنار هم چيد. اين معيارها ميتوانند همان مارکرها باشند.
2- Gene tagging: عبارتست از يافتن پيوستگي بين صفت موردنظر با يک مارکر، اين امر با بررسي تفرق همزمان(Cosegregation) صفت و مارکر تحقق مييابد.
3- Gene mapping: عبارتست از تعيين محل يک ژن روي کروموزوم.
4- بررسي روابط خويشاوندي: با استفاده از پليمورفيزم مارکري ميتوان افراد مختلف را از هم متمايز ساخت. اين مورد بيشتر در مطالعات فيلوژنتيکي و تعيين مبدا تنوع اهميت دارد.
5- تعيين گروههاي هتروتيک: در تهيه بذر هيبريد تعيين لاينهاي اينبرد والديني اهميت زيادي دارد. اين والدين بايد طوري انتخاب شوند که تعداد هتروزيس حداکثر باشد. مقدار هتروزيس به ميزان غالبيت در هر لوکوس و فاصله ژنتيکي والدين بستگي دارد. اين فاصله ژنتيکي را ميتوان از آناليز کلاستري که با استفاده از پليمورفيزم مارکري در بين لاينهاي مختلف به دست ميآيد، تعيين کرد و بهترين اينبردها را انتخاب نمود.
7-انتخاب به کمک مارکر (26MAS):مهمترين کاربرد مارکرها در اصلاح نباتات است. هدف اين است که بتوان صفت مورد نظر را با واسطه مارکر پيوسته با صفت، انتخاب کرد. اين مساله بسيار مهم است چرا که اگر پيوستگي يک مارکر با ژن موردنظر تاييد شود آنگاه ميتوان در هر مرحلهاي از رشد گياه و در هر محيطي اقدام به گزينش نمود. اغلب صفات مهم زراعي مثل عملکرد،
مقابله با خشکي و شوري و … صفاتي کمي هستند که توسط لوکوسهاي کمي (QTL27) کنترل ميشوند. لذا امروزه در پروژههاي اصلاحي سعي بر نقشهيابي QTLها است تا بتوان از آنها در MAS استفاده کرد.
7-حفظ ذخاير ژنتيکي: به کمک مارکرها ميتوان تنوع ژنتيکي موجود را بررسي کرد و در حفظ و سازماندهي آن اقدام نمود(12).
1-14 واکنش زنجيرهاي پليمراز (PCR)
اين تکنيک در اواسط دهه 1980 بوسيله کري موليس و همکاران معرفي شد (62). روشي است براي همانندسازي گزينشي و مکرر تواليهاي مشخصي از DNA. راهکاري است براي توليد نسخههاي بيشمار از يک توالي ويژه DNA، بدون اينکه به عمليات وقتگير کلون کردن نيازي داشته باشد. PCR از نظر اصول عملي تشابه زيادي به همانند سازي DNA دارد. براي انجام PCR هر ناحيه از هر مولکول DNA به شرطي که تواليهاي دوطرفه آن شناخته شده باشد قابل انتخاب است بدين دليل که بايستي دو اليگونوکلئوتيد کوتاه با مولکول DNA هيبريد گردند يعني هر کدام به يکي از رشتههاي مارپيچ دوتايي DNA متصل شود. اين اليگونوکلئوتيدها که به عنوان آغازگر28 براي سنتز DNA بکار ميروند ناحيهاي را که بايستي تکثير شود محدود مينمايند تا کپي شدن الگوي DNA توسط آنزيم پليمراز امکانپذير شود. براي تسهيل در اتصال آغازگر به DNA الگو، لازم است که اول رشتههاي DNA توسط حرارت از هم باز شوند، سپس دماي واکنش کاهش داده ميشود تا جفتشدن آغازگر با توالي موردنظر صورت پذيرد. در نهايت واکنش پليمريزاسيون توسط آنزيم DNA پليمراز براي توليد رشته مکمل انجام ميشود.
1-14-1 مراحل واکنش زنجيرهاي پليمراز
1- مرحله شروع29: به مدت ? تا ? دقيقه دماي محلول به ?? تا ?? درجه سانتيگراد رسانده ميشود (در صورتي که پليمرازها به حرارت بالا مقاوم باشند دما تا 98 درجه سانتيگراد نيز ميرسد). اين مرحله فقط براي DNA پليمرازهايي ضروري است که نيازمند فعال شدن توسط حرارت هستند.
2- مرحله واسرشت30: اين مرحله شامل تجزيه DNA از حالت دو رشتهاي به حالت تکرشتهاي است. در واقع اولين قسمت از سيکلهاي حرارتي منظم است و شامل حرارت دادن محلول به مدت ?? تا ?? ثانيه در دماي ?? تا ?? درجه ميباشد. در اين مرحله بهعلت گسستن پيوندهاي هيدروژني بين نوکلئوتيدها، DNA الگو و آغازگرها از هم جدا ميشوند و تکرشتههاي DNA حاصل ميگردند.
3- مرحله اتصال31: اين مرحله بسيار مهم است. دماي بهينه اتصال بستگي به نوع آغازگرهاي مورداستفاده دارد. دماي محلول به مدت ?? تا ?? ثانيه به ?? تا ?? درجه کاهش مييابد. در اين مرحله آغازگرها به تکرشتههاي DNA الگو متصل ميشوند. پيوندهاي هيدروژني پايدار تنها زماني شکل ميگيرد که توالي آغازگر و رشته الگو مکمل يکديگر باشند. آنزيم پليمراز پس از اتصال به هيبريد آغازگر- الگو، همانندسازي DNA را آغاز ميکند (69).
4- مرحله طويل شدن32: اين مرحله شامل بسط دادن دنباله آغازگر توسط آنزيم DNA پليمراز است. دماي محلول در اين مرحله بايد متناسب با نوع DNA پليمراز مورداستفاده باشد. براي انجام اين مرحله از يک DNA پليمراز ويژه به نام تک DNA پليمراز33 استفاده ميشود. دماي اپتيمم براي اين آنزيم حدود ?? الي ?? درجه است. در اين مرحله آنزيم DNA پليمراز با استفاده از dNTPهاي موجود در محلول، يک رشته DNA جديد را در جهت ‘? به ‘? و در مقابل رشتههاي الگو ميسازد. مدت زمان اين مرحله نيز بايد متناسب با نوع DNA پليمراز و طول رشته DNA باشد. در دماي بهينه، DNA پليمراز در هر دقيقه، يک هزار باز را پليمريزه مينمايد. در مرحله طويل شدن در صورت وجود سوبستراي کافي و تأمين شرايط بهينه، مقدار DNA در محلول PCR دو برابر ميشود. بنابر اين در هر چرخه PCR، غلظت DNA بصورت تصاعدي افزايش مييابد (روش PCR آنچنان سريع عمل ميکند که پس از گذشت 20 چرخه از آن، 1048576 نسخه از توالي موردنظر توليد خواهد شد). تعداد چرخهها معمولاً بين 25 تا 45 چرخه است و با افزايش اين تعداد، افزايش محصولات غيراختصاصي ديده ميشود. زمان هر چرخه بستگي به زمان لازم براي گرم شدن و خنک شدن بين چرخهها دارد.
?- مرحله طويل شدن نهايي34: اين مرحله، پس از آخرين چرخه PCR، به مدت ? الي ?? دقيقه در دماي ?? الي ?? درجه انجام ميشود تا اطمينان حاصل شود که همه تکرشتههاي DNA همانندسازي شدهاند .
نگهداري نهايي35: در اين مرحله، محلول نهايي به مدت کوتاهي در دماي ? الي ?? درجه قابل نگهداري است.
شکل 1-5 واکنش زنجيره اي پليمراز
1-15 تجزيه و تحليل دادهها
1-15-1 دندروگرام :
دندروگرام از دو واژه يوناني Dendron ، به معني درخت و gramma به معني کشيدن گرفته شده است و شامل يک نمودار درختي است که اغلب براي شرح و توضيح آرايش و نظم و ترتيب خوشهها به کار ميرودو به وسيله يک خوشهبندي مرتبهاي به وجود آمده است. دندروگرام اغلب در محاسبات بيولوژي براي شرح خوشهبندي اقلام بکار ميرود. دندروگرام يک اصطلاح گسترده براي نمايش يک درخت تکامل نژادي است. آناليز خوشهاي شامل چندين تکنيک متوالي است که براي تشخيص گروههائي از جنسهاي مشابه درون يک گروه خاص کاربرد دارد. در واقع آناليز خوشهاي، اطلاعات کلي ما را در چندين گروه مجزا تقسيم ميکند . روش خوشهبندي مرتبهاي توان ردهبندي انواع متفاوتي از اقلام را از اقلام بسيار مشابه با يکديگر تا خوشههاي بزرگي که شامل اقلام بسيار ناهمسان هستند را داراست. اين روش تجزيه و تحليلي معمولا يک محصول گرافيکي توليد ميکند که دندروگرام يا درختواره ناميده ميشود که در واقع همان ساختار خوشهاي مرتبهبندي شده را نشان ميدهد. بعضي از اين روشهاي ردهبندي

این نوشته در No category ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *