منابع و ماخذ پایان نامه نشانگرهاي، مبتني، روش‌هاي

د كه موجب مي‌شود ارزيابي تنوع تحت تأثير محيط باشد. با بررسي مجموعههاي ژنتيکي با استفاده از نشانگرهاي مولکولي مبتني بر DNA، تفاوتهاي ژنتيکي بيشتري مشاهده شده، اين تفاوتها تحت تأثير محيط و اثراتي مانند پليوتروپي، اپيستازي و دوره رشدي گياه نخواهند بود و امکان آگاهي دقيق و کافي از تنوع ژنتيکي در سطح DNA را فراهم ميسازند. با توجه به اهميت روزافزون توليد واريتههاي برتر و نياز به شناسايي و استفاده از آللها و ژنهايي که صفات مطلوبي را کنترل مينمايند، استفاده از نشانگرهاي DNA روزافزون خواهد بود.
1-12 انواع نشانگرها:
مارکرها انواع مختلفي دارند. در يک تقسيمبندي کلي ميتوان مارکرها را به صورت زير دستهبندي کرد:
1- مارکرهاي مورفولوژيکي يا فنوتيپي
2- مارکرهاي مولکولي
مارکرهاي مولکولي خود به دو دسته تقسيم ميشوند:
1- مارکرهاي بيوشيميايي
2- مارکرهاي DNA
1-12-1 نشانگرهاي مورفولوژيکي
مارکرهاي مورفولوژيکي همانگونه که از نام آنها مشخص است از روي فنوتيپ ارزيابي ميشوند و لذا ارزيابي آنها خيلي ساده است. تعداد اين مارکرها کم است و پليمورفيزم کمي نيز توليد ميکنند. از طرفي در اغلب موارد مارکر فنوتيپي در واقع يک صفت نامطلوب است، مثلا کوتولگي بوته، ابلق بودن برگ ها و … . لذا امروزه از اين نوع مارکرها استفاده نميشود. نشانگرهاي مورفولوژيکي اولين نشانگرهايي بودند که براي ارزيابي تنوع ژنتيکي مورد استفاده قرار گرفتند (20). نشانگرهاي مورفولوژيك كه پيامد جهشهاي قابل رويت در مورفولوژي هستند، شامل دامنه وسيعي از ژن‌هاي كنترلكننده صفات مورفولوژيك ميشوند كه بر ظاهر يا فنوتيپ موجود مبتني بوده و جزو نخستين نشانگرها به شمار ميآيند كه از زمانهاي بسيار دور، يعني زماني كه هنوز محل ژن روي كروموزوم مشخص نشده بود، مورد استفاده قرار ميگرفتند. دلايل عمده محدوديت استفاده از نشانگرهاي مورفولوژيکي عبارتند از: تعداد اين نشانگرها کم بوده، وابسته به سن و مرحله رشدي گياه هستند و غالباً از شرايط محيطي تأثير ميپذيرند و درضمن اساس ژنتيکي بسياري از آنها هنوز مشخص نشده است. در صورتي که هنوز بررسي تنوع ژنتيكي بر اساس صفات مورفولوژيک يک گام اوليه در جهت توصيف و گروهبندي ژرمپلاسمها است (57).
1-12-2 نشانگرهاي بيوشيميايي
نشانگرهاي بيوشيميايي شامل موارد متعددي است. اين نوع مارکرها نيز امروزه کارايي زيادي ندارند چرا که تعداد آنها کم بوده و پليمورفيزم کافي ايجاد نميکنند، ليکن نکته مثبت در آنها همبارز بودن است.
اين گروه را ميتوان به دستههاي زير تقسيم کرد:
الف. مولکولهاي بيوشيميايي کوچک: مثل ترکيبات فنلي، ترکيبات معطر و …
ب. پروتئينهاي ذخيرهاي: مثل گلوتنين و گليادين که در گندم خصوصا در تعيين ارزش نانوايي کاربرد دارد.
ج. آيزوزايمها: اينها در واقع فرمهاي مختلف يک آنزيم هستند که يک واکنش را کاتاليز ميکنند ولي ممکن است سرعت فعاليت آنها متفاوت باشد. اين مارکرها در دهه 80 کاربرد زيادي داشتند. تنکسلي توانست بر اساس آيزوزايمها در گوجه فرنگي اولين نقشه لينکاژي را طراحي نمايد. و معايب آيزوزايم‌ها عبارتند از: تنها تعداد محدودي آيزوزايم براي هر گونه وجود دارد، تعداد سيستم‌هاي آنزيمي چند شکل و قابل دسترس محدود است و مكان‌هاي آنزيمي فقط شامل قسمت محدود و غيرتصادفي از ژنوم هستند (قسمت بيانشونده). بنابراين تنوع مشاهده شده ممكن است بيانگر كل ژنوم نباشد. اگرچه با اين روش مي‌توان تعداد زيادي از نمونه‌ها را بررسي کرد ولي مقايسة نمونه‌ها از گونه‌هاي مختلف، مكان‌هاي ژني و آزمايشگاه‌هاي مختلف مشكل ساز است. بطوريكه اين روش تحت تأثير روش‌هاي استخراج، بافت گياه و مرحلة رشد گياه قرار مي‌گيرد(62و42).
د. آللوزايم‌ها آلل‌هاي متفاوت آنزيم‌ها هستند كه يك ارزيابي از فراواني ژني و ژنوتيپي در درون و بين جمعيت‌ها ارائه مي‌دهند که اين اطلاعات مي‌توانند جهت گروه‌بندي جمعيت‌ها، تنوع ژنتيكي، جريان ژن، ساختار ژنتيكي گونهها، مقايسة ميزان تلاقي‌هاي بين‌گونه‌اي، ساختار جمعيت و واگرايي جمعيت‌ها استفاده شوند (42).
مزيتهاي مهم اين‌گونه نشانگرها عبارتند از: ارزيابي به صورت هم‌بارز و بدون دخالت تأثيرات اپيستازي و پليوتروپي، كاربرد آسان و هزينة پائين.
1-12-3 نشانگرهاي مولكولي مبتني بر DNA
مارکرهاي DNA در واقع مهمترين و کاربرديترين سيستمهاي مارکري هستند که گستردگي زيادي داشته و هرروزه در حال توسعه و تکامل هستند. از آنجا که در اولين سطح بيان ژن مطرح ميشوند، خيلي دقيق بوده، داراي تنوع زياد و پليمورفيزم بالا هستند.
نشانگرهاي مولكولي بر اساس آشكارسازي تفاوت‌ (چندشکلي10) موجود در بين اسيدهاي نوكلئيك افراد مختلف عمل مي‌كنند. اين تفاوت‌ها شامل پديده‌هاي حذف، اضافه، جابجايي، دو برابر شدن و جهش‌هاي نقطه‌اي است و تنها ژن‌هاي خاص و فعال را شامل نمي‌شود. نشانگرهاي مولكولي علاوه بر اينكه تحت تأثير محيط نيستند داراي مزيت‌هاي زير ميباشند:
1- تمام قسمت‌هاي ژنوم را پوشش مي‌دهند (اگزون‌ها، اينترون‌ها و نواحي تنظيمكننده).
2- تحت تأثير پليوتروپي و اپيستازي قرار نمي‌گيرند.
3- قادر به شناسايي تفاوت‌هايي هستند كه تنوع فنوتيپي نشان نمي‌دهند.
4- بعضي از آنها هم‌بارز هستند.
روش‌هاي مختلف مورد استفاده شامل: هضم و هيبريداسيون اسيدهاي نوکلئيک، روشهاي مبتني بر واكنش‌هاي زنجيره‌اي پليمراز (11PCR) و يا تركيبي از دو روش ذكرشده هستند. بعلاوه روش‌هاي مختلف نشانگري مي‌توانند يك مكان يا چند مكان ژنومي را مورد بررسي قرار ‌دهند. بطوريکه نشانگرهاي چند مکاني12 قادرند بطور همزمان چندين مکان ژنومي را مورد بررسي قرار دهند. اين نشانگرها مبتني بر تكثير تصادفي DNA بواسطة آغازگرهاي اليگونوكلئوتيدي با توالي‌هاي انتخابي هستند، اين گونه نشانگرها را نشانگر‌هاي غالب نيز مي‌نامند. بنابراين امكان تشخيص حضور يا عدم حضور باند براي هر مکان وجود دارد ولي امكان تشخيص حالت‌هاي هتروزيگوت (A/-) يا هموزيگوت (a/a) براي آلل‌هاي مشابه وجود ندارد. در حاليكه نشانگرهاي يك مكاني13 از كاوشگرها يا آغازگرهاي ويژه براي مكان‌هاي ژني استفاده مي‌كنند و قادر به تكثير يا دورگگيري DNA با توالي‌هاي شناختهشده هستند. اين نشانگرها را نشانگرهاي هم‌بارز نيز مي‌نامند كه امكان تشخيص مكان‌هاي هموزيگوت و هتروزيگوت را به ما مي‌دهند(42).
روش‌هاي نشانگري پايه را مي‌توان به 2 دسته تقسيم كرد:
1-روش‌هاي غير مبتني بر PCR يا روش‌هاي مبتني بر هيبريداسيون.
2-روش‌هاي مبتني بر PCR
1-12-3-1 روش‌هاي غير مبتني بر PCR
روشهاي مولكولي مبتني بر هيبريداسيون از اولين نشانگرهايي هستند که در مطالعات گياهي مورداستفاده قرار گرفتند. اين نشانگرها شامل استفاده از آنزيم‌هاي برشي و روش‌هاي دورگگيري بودند (59). آندونوكلئارهاي هضمكننده، آنزيم‌هاي باكتريايي هستند كه قادر به شناسايي توالي‌ پاليندرم ويژه و برش DNA هستند كه اين برش سبب ايجاد قطعاتي با اندازه‌هاي مختلف مي‌شود. تغييرات درون توالي (مثل جهش نقطه‌اي)، جهشهاي بين مكاني (مثل حذف و جابجايي) و جهشهاي درون مكان آنزيمي مي‌توانند منجر به تفاوت طول قطعات بعد از برش آنزيمي شوند. نشانگرهاي RFLP14 و تعداد متفاوت رديف‌هاي تكراري (15VNTR)، نمونه‌هايي از نشانگرهاي مبتني بر هضم و هيبريداسيون هستند. در RFLP چندشكلي DNA بوسيلة هيبريداسيون كاوشگر (كه به روش شيميايي نشاندار شده است) با قطعاتDNA انتقال سادرنيافته انجام مي‌گيرد كه سبب ايجاد پروفايلهايي از قطعات DNA ميشود. نشانگر RFLP داراي چندشكلي نسبتاً زيادي است، توارث همبارز داشته و تكرارپذيري بالايي نشان مي‌دهد. در اين روش لكه‌هاي DNA حاصل از دورگ گيري را مي‌توان پاك كرد و قطعات انتقال سادرنيافته را دوباره با کاوشگرهاي 16‌ RFLP جديد (8 تا 10 مرتبه) مورد بررسي قرار داد. با اين وجود، اين روش‌ها به علت وقت‌گير بودن، داشتن مواد راديواكتيويتهي گرانقيمت و سمي و نياز به DNA با كيفيت و كميت بالا به طور وسيع مورداستفاده واقع نمي‌شوند. بعلاوه اين نشانگرها به اطلاعات اوليه از توالي DNA‌ جهت ساختن كاوشگر نياز دارند كه سبب پيچيدگي روش مي‌شود. اين محدوديت‌ها سبب شده است كه روش‌هاي با پيچيدگي كمتر مانند نشانگرهاي مبتني بر PCR توسعه يابند (42). بازرترين نوع اين مارکرها، RFLP ميباشد. VNTRها و ميکروستلايتها نيز در اين گروه قرار دارند. در اين نوع مارکرها يک قطعه DNA نشاندار شده (پروب) جهت هيبريداسيون استفاده ميشود. RFLP در سال 1980 توسط Botstain ابداع شد و دقت بسيار زيادي دارد، ليکن امروزه صرفا به دليل وقتگير و پرزحمت بودن آن، کمتر استفاده ميشود.
1-12-3-2 نشانگرهاي مبتني بر PCR
اين نشانگرها كه كاربرد آنها سير صعودي دارد، توسط موليس و همكارانش (1986) توسعه پيدا كرده و از واكنش‌هاي زنجيره‌اي پلي‌مراز (PCR) پيروي مي‌كنند. اين تكنيك شامل تكثير چندين قطعه DNA مجزا است كه توالي‌هاي اطراف آنها بسيار مشابه آغازگر مي‌باشد، اين نواحي بايد به قدر كافي به همديگر نزديك باشند تا تكثير انجام گيرد. استفاده از آغازگرهاي تصادفي محدوديت داشتن اطلاعات اوليه براي انجام PCR را ندارد. روش‌هاي مبتني بر PCR را مي‌توان به دو گروه: 1- روش‌هاي مبتني بر PCR تواليهاي غير ويژه. 2- روشهاي مبتني برPCR توالي‌هاي هدف17 تقسيم كرد. در اين قسمت تعدادي از نشانگرهاي مبتني بر PCR توضيح داده ميشود (42).
1-12-3-2-1 نشانگرRAPD18:
نشانگر RAPD، نخستين نشانگر مولکولي مبتني بر واکنش زنجيره پليمراز بود که براي بررسي تنوع ژنتيکي مورداستفاده قرار گرفت. ماركرهاي RAPD از طريق تكثير تصادفي DNA ژنومي و با استفاده از آغازگرهاي كوتاه ايجاد ميشوند. تفکيک قطعات حاصل بر روي ژل آگارز در حضور اتيديوم برومايد صورت ميگيرد، و در نهايت، زير نور ماوراء بنفش مشاهده ميگردد. اگرچه آغازگرها داراي تواليهاي تصادفي هستند، قادر به يافتن تواليهاي هومولوگ مناسب روي رشته DNA ميباشند. چندشكليهاي DNA بدليل نوآرايي يا حذف در محل اتصال آغازگرها يا ناحيه قابل تکثير ايجاد ميشوند (68).
1-12-3-2-2 نشانگر19AFLP:
براي غلبه بر محدوديت تکرارپذيري RAPD، تکنولوژي AFLP توسط شرکت هلندي کيجن20 توسعه پيدا کرد (68). نشانگر AFLP توسط هضم DNA با دو يا چند آنزيم برشي، اتصال آداپتور به دو انتهاي قطعات، PCR با آغازگرهاي اختصاصي و جداسازي قطعههاي حاصل روي ژل پلي اکريل اميد صورت ميگيرد (12). با توجه به نتايج بدستآمده از آن تکنيک مقرون به صرفه و داراي تکرارپذيري، ثبات و قابليت اطمينان بيشتري نسبت به مارکر RAPD ميباشد به همين دليل بطور وسيعي در تهيه نقشه کروموزومي گياهان مورداستفاده قرار گرفته است. در استفاده از اين مارکر بايد مراحل انجام کار با دقت و کيفيت بالا صورت گيرد (65).
1-12-3-2-3 نشانگر21SSR:
مورگانت و اوليويري در سال 1993 براي اولين بار ريزماهوارهها را در توالي گياهان گزارش کردند. ريز ماهوارهها يا رديف هاي تکراري ساده (SSR) شامل واحدهاي نوکلئوتيدي تکي تا شش تايي تکرار شونده هستند که در ژنوم بيشتر يوکاريوتها پراکندهاند (26). معمولاً تکرارهاي 1 تا 4 نوکلئوتيدي در ژنوم يوکاريوتها بيشتر يافت ميشوند. ريزماهوارهها به صورت طبيعي در نواحي غير کدکننده DNA از قبيل اينترونها و تـواليهاي بين ژني ديده ميشوند. ريـز مـاهوارهها معمولاً نـزديک بـه SINEs22 و LINEs23 ها و نزديک به عناصر شبه رتروترانسپوزونها ديده ميشوند (25). ريزماهوارهها به نواحي کدکننده ژنوم نيز متصل
شدهاند (18). ريزماهوارهها در نقشهيابي ژنومي، انگشتنگاري DNA، سازماندهي ژرمپلاسم و مطالعات سيتوژنتيکي و ارزيابي تنوع ژنتيکي

این نوشته در No category ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *