منابع و ماخذ پایان نامه برومايد، اتيديوم، تهيه

وقتي مخلوطي از ذرات باردار در يک محيط الکتروفورزي قرار مي گيرند، هر ذره باردار با يک سرعت خاص حرکت مي کند و ميزان حرکت هر ذره به قدرت ميدان الکتريکي، اندازه، شارژ خالص ذره و نوع محيط هادي وابسته است. عمده ترين محيط هاي هادي مورد استفاده در سيستم الکتروفورز ژل آگارز، اکريلاميد و نشاسته هستند. در منافذ اين ژل ها بافر قرار مي گيرد تا جريان الکتريکي هدايت شود و مولکول ها به راحتي مهاجرت کنند. اين ژل ها در شکل ها، اندازه ها و همچنين تعداد منافذ مختلف قابل ريختن هستند. انتخاب اين شاخص به طور عمده به اندازه قطعاتي که قرار است در سيستم الکتروفورزي از همديگر تفکيک شوند، وابسته است. در محيط الکتروفورزي مولکول هاي مشابه باسرعت مشابه حرکت مي کنند و پس از مدتي در يک نقطه متمرکز مي شوند ويک باند يا نوار تشکيل مي دهند. بدين ترتيب مي توان مولکول هاي مختلف را از همديگر جدا کرد (3).
شکل 2-5 دستگاه الکتروفورز
2-6-1 محلول اتيديوم برومايد
اتيديوم برومايد با فرمولBr3N20H21C و وزن مولكولي 4/394 گرم بر مول (شکل2-6) به عنوان يك نشان غير راديواكتيوبراي تشخيص و ديدن باندهاي اسيد نوكلئيك در الكتروفورز و در روش جداسازي اسيدنوكلئيك ها بر اساس ژل استــفاده ميشود. اتيديوم برومايد يك ماده قرمز تيره، كريستالي، جامد، غير فرار، به طور متوسـط محلول در آب، كه داراي خاصيــت فلورسنس و رنگ قهوه اي مايل به قرمز در هنگام قرار گرفتن در معرض اشعه UV مي باشد. اگر چه يك ابزار مناســبي جهت تحقيق مي باشد ولي به خاطر خصوصيات خطرناك آن، بايستي در هنگام جابجايي و دفع به نكات ايمني و بهداشتي آن توجه نمود .اتيديوم برومايد يك موتاژن قوي با خاصيت سمي متوسط بعد از يك تماس حاد است. اتيديوم برومايد ميتواند از طريق پوست جذب فوري شود، بنـابراين ممانعت از تماس با اين ماده شيـميايي بسيـار مهم مي باشــد. اين ماده همچنين محرك پوست، چشم، بيني و دستگاه فوقاني مي باشد. يك محلول پايه با غلظت 10 ميلي گرم بر ميلي ليتر تهيه شده و با غلظت 1ميكروگرم بر ميلي ليتر مورد استـفاده قرار ميگيــرد. ژلــها پس از الكتــروفورز در ظرف جداگانه اي كه حاوي محلول اتيديوم برومايد است، قرار گرفته و پس از شستشو با آب مقطر، آماده عكسبرداري ميگردند (12).
شکل 2-6 ساختار اتيديوم برومايد
2-6-2 تهيه ژل الکتروفورز
براي انجام الکتروفورز محصولات حاصل از PCR در اين تحقيق، از ژل آگارز 3درصد استفاده گرديد. براي تهيه ژل، 6گرم آگارز به همراه 200 ميلي ليتر بافر TBE 10X در شيشه ريخته شده سپس مواد در مايکروفر حرارت داده شدند تا مايع شفافي به دست آيد. محلول در دماي اتاق قرار داده شده تا خنک شود، سپس 8 ميکروليتر اتيديوم برومايد به محلول افزوده شد. سيني الکتروفورز افقي از دو طرف با اسفنج محکم شد و برروي يک سطح تراز قرار داده شد و محلول با دقت بدون ايجاد هرگونه حبابي در ژل در سيني ريخته شد، سپس شانه هاي مخصوص سيني در محل خود قرار داده شدند. پس از بسته شدن کامل ژل، اسفنج هاي اطراف سيني برداشته شده و شانه ها با احتياط از ژل خارج شدند و سيني به همراه ژل در بافر X TBE 5/0 در دستگاه الکتروفورز افقي قرار داده شد، به صورتي که ژل نيم سانتي متر در بافر فرو رود. قابل توجه است که بـراي تهيه ژل و انجام الکتروفورز نيازمند به بـافر ( X5/0) اسـت. بـراي تهيه cc 1000 بافـر (X5/0) ميزان cc50 از بافر TBE X10 را بوسيله آب ديونيزه به حجم cc1000رسانده شد(3).
2-6-3 الکتروفورز محصول PCR
به هر تيوپ DNA حاصل از PCR، 3 ميکروليتر بافر بارگذاري اضافه گرديد، سپس از هر نمونه 12ميکروليتر در هر چاهک تزريق شد. پس از اينکه تک تک نمونه ها در چاهک ها قرار گرفتند، در چاهک اولي يا آخري 2 ميکروليتر از DNA ladder (100bp Plus) که از شرکت سيناژن تهيه شد، قرار داده شد. الکتروفورز با ولتاژ 50 ولت بر سانتي متر و به مدت 5 ساعت انجام گرفت. سپس ژل از دستگاه خارج شد و در زير نور ماوراء بنفش (UV) در دستگاه Gel Logic 212 pro Imaging system (Caresteam, USA) باندها مشاهده شدند و عکس برداري انجام گرفت(شکل2-7).
شکل2-7 دستگاه ژل داك
2-7 تجزيه و تحليل داده ها:
استفاده از روش نشانگرهاي مولكولي مبتني بر DNA جهت بررسي تنوع ژنتيكي، منجر به توليد حجم عظيمي از داده ها ميشود. روش هاي آماري چند متغيره تكنيكي مناسـب جهت تجزيه وتحليل و مديريـت اين داده ها مي باشد، كه از بيــن اين روش ها تجزيه كلاستر و تجزيه به مختصات اصلي جهت گروه بندي نمونه ها به وفور استفاده مي شوند. در هنگام استفاده از نشانگرهاي مولكولي، صفات مورد بررسي در واقع باندهايي مي باشند كه با يك آغازگرتوليد مي شوندحضور باند با عدد يك و عدم حضور باند باعدد صفر نشان داده مي شود. براي تجزيه داده ها از ديدگاه بررسي تنوع ژنتيكي در اين نشانگر ماتريس صفر و يك تشكيل مي شود.
آناليز خوشهاي با استفاده از نرمافزار POPGEN32 انجام گرفت. دندروگرام ژنوتيپها بر اساس روش UPGMA بدست آمد. تشابه ژنتيکي بين ژنوتيپها با استفاده از ضريب تشابه Nei محاسبه شد(58).
فصل سوم:
نتايج و بحث
3-1 پليمورفيسم
در اين پروژه از 16 ترکيب پرايمري SRAP استفاده شد، از ميان آنها 11 ترکيب که نسبت به سايرين چندشکلي قابل توجهي را نشان دادند و داراي باندهاي تکرارپذير و واضح بودند، انتخاب شدند. 5 ترکيب پرايمري ME4-EM6 ، ME3-EM4، ME8-EM18، ME8-EM19 و ME8-EM20 در برخي جمعيتها وضوح و قابليت تکرار کافي را نداشتند بنابراين کنار گذاشته شدند. همه 11 جفت پرايمر به کار برده شده با موفقيت باندهاي قابل تفسير و خوانا براي گونهي موردنظر ايجاد کردند. براي نمونه يکي از الگوهاي باندي بهدستآمده از محصولات PCR به وسيله يکي از آغازگرهاي SRAP در شکل 3-1 نشان داده شده است. اين شکل به وضوح وجود چندشکلي در DNA بينجمعيتي با توجه به هر نمونه براي پرايمر را نشان ميدهد. براي پي بردن به تنوع بين جمعيتها با استفاده از محاسبات آماري و تبديل دادهها از روي پروفيل باندي حاصل براساس هر آغازگر، کدگذاري به صورت (1) براي حضور باند و (0) براي عدم حضور باند، صورت گرفت که در جدولهاي3-1 نمونهاي از نتايج نشان داده شده است.
شکل 3-1 الگوي باندي قطعات تکثير شده براي جفت آغازگر Me2-Em2 به ترتيب از چپ به راست براي نمونه هاي A1 تا B5
جدول 3-1 نتايج کد گذاري آغازگر Me2-Em2 براي همهي جمعيتها
POP2
POP1
1
B1
1
1
A1
1
1
B2
1
1
1
A2
1
1
B3
1
1
1
A3
1
1
B4
1
1
1
A4
B5
1
1
A5
B6
1
1
1
A6
1
B7
1
1
1
1
A7
1
B8
1
1
A8
1
B9
1
A9
1
1
1
B10
1
1
1
POP4
POP3
1
1
D1
1
1
C1
1
1
D2
1
C2
1
1
D3
1
C3
1
D4
1
C4
1
D5
C5
1
D6
1
C6
1
D7
1
C7
1
1
D8
1
1
C8
1
D9
1
1
C9
1
D10
1
C10
1
1
C11
POP5
1
E1
1
E2
1
E3
1
E4
1
E5
1
E6
1
E7
1
E8
1
E9
1
E10
همهي پرايمرها چندشکلي بالايي را نشان ندادند. فراواني باندها اختلافاتي در اين جمعيتها نشان ميدهد. اين اختلافات براي نشان دادن کارآمدي به کارگيري پرايمرهاي مختلف براي مجزا کردن جمعيتها مهم هستند. در مجموع از 32 قطعه تکثير يافته به وسيله 11 ترکيب پرايمري، 5 قطعه همشکل و 27 قطعه چندشکل بودند (38/84%). بيشترين تعداد قطعه تکثيرشده 5 عدد و مربوط به جفت آغازگرهاي ME2-EM6 و ME2-EM2 بود در حاليکه کمترين تعداد 1 عدد و مربوط به جفت آغازگرهاي ME1-EM6 و ME1-EM3 بود و بيشترين وکمترين درصد باندهاي چندشکل هم به ترتيب 100% و 50% بود(جدول 3-2) و اندازه قطعات DNA حاصل بين bp 400 – 100 بود.
جدول3-2 نتايج چندشکلي پرايمرهاي استفاده شده در اين تحقيق
درصد چند شکلي
تعداد قطعات چند شکل
کل قطعات تکثير شده
پرايمر
100%
1
1
Me1-Em3
100%
1
1
Me1-Em6
100%
5
5
Me2-Em2

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *