منابع و ماخذ پایان نامه استان کرمانشاه، استان کرمان، استان فارس

اين مارکر بررسي کردند که در سطح گونه پليمورفيسم بالايي مشاهده شد و درصد پل مورفيسم درونگونهاي 84% بود اما پليمورفيسم بينگونهاي 15% بود و درنتيجه تمايز ژنتيکي متوسطي بين جمعيتها وجود داشت(37).
ليائو و همکاران در سال 2012 تنوع ژنتيکي 25 جمعيت وحشي و يک جمعيت زراعي Prunella vulgarisرا با استفاده از اين مارکر بررسي کردند و درصد پليمورفيسم حدود 88% محاسبه گرديد و جمعيتها در سه گروه دستهبندي شدند(33)
مطالعات درون گونهاي و بينگونهاي ديگري نيز بر روي Cynodon radiatus(29) Ziziphus (34)Coffea arabica (Rubiaceae) (41) با استفاده از مارکر SRAP انجام شده است که پليمورفيسم محاسبه شده قابلتوجه بوده است.
همانطور که گفته شد در تمامي مطالعات انجام شده توسط مارکرSRAP چه بر روي گياهان علفي و چه بر روي گياهان درختي و درختچهاي و به ويژه خانوادهFagaceae پليمورفيسم حاصله بالا بوده و اين مارکر يک مارکر کارآمد ميباشد.
تاکنون تنوع ژنتيکي هيچ گونهاي از Quercus با اين مارکر بررسي نشده و اين اولين گزارش ميباشد.
فصل دوم:
مواد و روش ها
2-1 انتخاب مناطق و جمعيتها
به صورت تصادفي 5 منطقه در طول زاگرس از استان کرمانشاه تا استان فارس مشخص شدند که اسامي اين مناطق و عرض و طول جغرافيايي آنها در جدول آمده است (جدول2-1).
جدول 2-1 اسامي جمعيت ها و مناطق بررسيشده در اين تحقيق
کد
محل اصلي
ارتفاع از سطح دريا
عرض جغرافيايي
طول جغرافيايي
POP1
ياسوج
1950
30 35.791 N
51 31.908 E
POP2
برمدشت- کازرون
1370
29 33.166 N
51 52.822 E
POP3
بيستون- کرمانشاه
1490
34 22.497 N
47 16.663 E
POP4
آبدانان- ايلام
1660
33 04.170 N
47 19.201 E
POP5
خوزستان
2040
32 45.79 N
48 58.50 E
شکل2- 1 جمعيتها و مناطق بررسي شده در اين تحقيق
2-2 جمع آوري و آماده سازي نمونه هاي گياهي
در هر منطقه به طور متوسط 10 پايه به صورت تصادفي انتخاب شد که فواصل آنها از يکديگر حداقل 50 و حداکثر 100 متر بود و به هر پايه يک کد داده شد .
در بهار 1391 نمونههاي برگ تازه از قسمت سرشاخه برداشت شد و در درون کيسههاي پلاستيکي به همراه سيليکاژل قرار داده شد و بر روي يخ به آزمايشگاه منتقل شد.
در آزمايشگاه برگهاي تازه و جوان (شکل2-2) پس از پوشاندهشدن با آلومينيوم فويل در درون نيتروژن مايع36 قرار گرفتند سپس به فريزر 80- درجه سانتيگراد منتقل گرديده و تا زمان انجام آزمايشات در آنجا نگهداري شدند.
شکل2-2 نمونههاي برگ تازه در آزمايشگاه
2-3 استخراج DNA از نمونههاي گياهي
2-3-1 آماده کردن نمونهها
در پژوهشکده زيست فناوري دانشگاه اروميه نمونههاي برگي در هاون چيني همراه نيتروژن مايع بطور کامل پودر شدند. سپس به تيوبهاي ميکروفوژ37 استريل ml 5/1 منتقل شده و تا زمان استفاده در فريزر 80- درجه سانتيگراد نگهداري شدند.
2-3-2 استخراج DNA
استخراج DNA از بافتهاي برگي پودر شده و به روش CTAB38صورت گرفت (40).
2-3-2-1 مواد موردنياز
جهت تهيه محلول CTAB:
مقدار
ماده
2 %
CTAB
mM , pH=8 1/0
Tris-base
mM 5
EDTA
M 5/1
Nacl
4 %
?- mercaptoethanol
2 %
Polyvinyl pyrolidone
محلول بافرx) 10TBE ( :
مقدار
ماده
g 108
Tris base
g 55
Boric acid
g 3/9
EDTA
براي تهيه اين بافر، مواد با آب مقطر حل شده و حجم آن به يک ليتر رسانده شده و بعد از اتوکلاو، در دماي اتاق نگهداري شدند.
محلول بافر x) 5/0TBE (
براي تهيه اين بافر 50 ميلي ليتر از x )10TBE( به 950 ميلي ليتر آب مقطر اضافه شد(40).
ژل آگارز
اين ژل معمولاً به ميزان 1% تا 3% در بافرهاي مختلفي مانند TAE، TBE تهيه ميشود. براي تهيه ژل آگارز 1% 2 g از آگارز با10 ميليليتر بافر x) 10TBE ( مخلوط شد و بعد حجم آن با آب مقطر به 200 ميليليتر رسانده شد. به مدت 5 دقيقه در داخل مايکروويو حرارت داده شد تا بجوش آيد و آگارز حل شود. مدتي پس از سرد شدن l? 8 اتيديوم برومايد به آن اضافه گرديد(40) .
2-3-2-2 روش کار
1- 2/0گرم از بافت برگي پودر شده در ميکروتيوب ريخته شد.
2- مقدار 700 ميکروليتر از بافر CTAB به پودر برگ اضافه شد سپس به کمک ورتکس يا تکان دادن بهم زده شد و حدوداً تا2 ساعت داخل بنماري 60 درجه قرار داده شد و هر 5 دقيقه يک بار تکان داده شد.
3- مقدار 700 ميکروليتر از محلول کلروفرم-ايزوآميل الکل 24:1 به آن اضافه کرده و خوب محلول را تکان داده تا به رنگ شيري درآيد.
4- سپس آنرا در rpm 13000 به مدت 10 دقيقه سانتريفيوژ کرده و اين مرحله بسته به شفافيت محلول رويي 2 تا 3 بار تکرار شد.
5- مايع زلال بالايي با استفاده از ميکروپيپت برداشته شده و به تيوب ميکروفوژ ml5/1 استريل منتقل گرديد و به 3/2 حجم نمونه داخل تيوب محلول ايزوپروپانول سرد (نگهداري شده در 20- درجه سانتيگراد) اضافه شد و5 دقيقه خوب تکان داده شد.
6- محلول داخل تيوبها به مدت 10 دقيقه سانتريفوژ (4 درجه سانتيگرادrpm 13000) شد تا DNA در کف آن رسوب نمايد.
7- سپس مايع رويي را دور ريخته و رسوب DNA را با بافر شستشو (l? 100 اتانول 70% و l? 100 استات آمونيوم) 2 بار شستشو داده وگذاشته رسوب DNA خشک شود (اتانول به طور کامل تبخير شود).
8- در اين مرحله، l?100 RNasae رقيق شده به رسوب DNA اضافه کرده و به مدت 30 دقيقه در دماي 37 درجه در ترموميکسر قرارگرفت.
9- به نمونهها l?200، NaCl 5 مولار اضافه شد.
10- دو برابر حجم موجود در تيوب اتانول 100% اضافه شد (l?100 RNasae +l?200 Nacl).
11-نمونهها به مدت 20 دقيقه در فريزر 20- قرار داده شد.
12- نمونهها به مدت 5 دقيقه در دستگاه سانتريفوژ با دور rpm 13000 قرار گرفت.
13- مايع روئي بيرون ريخته شد و بعد رسوب DNA با l?100 اتانول 70% شستشو داده شد.
14- درانتها، به رسوب DNA، l?50 آب ديونيزه اضافه شد.
15- نمونهها به مدت 24 ساعت در دماي 20- درجه نگهداري شدند تا DNA به خوبي حل شود(40).
2-4 تعيين كيفيت وكميت DNA:
2-4-1 استفاده از ژل آگـارز:
در اين روش وضعـيتDNA از لـحاظ سالم بودن و نداشتن شكـستگي مـورد بررسي قرار گـرفت. در اين روش 5 ميكـروليتر DNA پايه از نمونه استخراجي با 5 ميكـروليتر آب مقـطر مخلوط و به آن 3 ميكـروليتر لـودينگ بافـر اضافه و در ژل آگارز 1% به مدت 60 دقيقه با ولـتاژ ثابت 80 ولت الكـتروفورز گـرديد. در نهايتDNAهايي انتخاب شدند كه بر روي ژل آگارز تشكيل يك باند پر رنگ در بالاي ژل دادند در صورتي كه نمونه DNA داراي شكستگي باشد، بر روي ژل حالت اسمير مشاهده ميشود(40).
2-4-2 روش اسپکتروفتـومتري:
اين روش بر مبناي اندازهگـيري طيف جذبي DNA توسط دستگاه اسپكـتروفتومتري ميباشد(شکل 2-3). ميزان جذب نور توسط اسيدهاي نوكليئك، پروتيئنها و تركيبات فنلي به ترتيب در طول موجهاي 260 ،280و 230 نانومتر صورت ميگيرد و طول موج 320 نانومتر معرف ميزان آلودگيها در نمونههاي استخراج شده است. خلوص كيفيت DNA بر اساس نسبت طولموجهاي 280/260 و 230/260 تعيين گرديد چنانچه نسبت 280/260 در محدوده 2-7/1باشد، DNA از كـيفيت قـابل قبولي برخوردار خواهد بود، همچنين اين دستگاه غلظت DNA (كميت) را نيز نشان ميدهـد.
غلظت DNA بر حسب نانوگرم در ميكروليتر از طريق فرمول زير محاسبه شد:
50 ? ضريب رقتA260 ? =غلظت DNA (نانو گرم در ليتر)
براي كاليبره نمودن دستگاه ابتدا درون كوئت ، 200 ميكروليتر آب ديونيزه ريخته و در دستگاه قرار داده شد پس از زدن كـليد
Blank زماني كه دستگاه عدد صفر را نشان داد كاليبره شده است. پس از كاليبره شدن، داخل كوئت، 198 ميكروليتر آب ديونيزه به همراه 2 ميكروليتر DNA استخراج شده ريخته و مقاديرA260 ، A280، A230 و غلظت بر حسب نانوگرم يـادداشت شد.در اين پـروسه چون 2 ميكـروليتر از محلول پايهDNA در 198 ميكرولـيتر آب ديـونيزه ريخته شد، پس محلول پايه 100 برابر رقيق شده است:
100 = 2/200 = ظريب رقت
در طول موج 260 نانومتر، OD مساوي يك برابر با 30 نانوگرم در ميكروليتر ds DNA Strand) (double است. جهت يكسان نمودن غلظت كليه DNA پايه در واكنش PCR (30 نانو گرم در ميكروليتر)، DNA با نسبت معيني از آب ديونيزه كه از فرمول زير بدست مي آيد رقيق شد:
C1V1=C2V2
C1= غلظت DNA در محلول پايه. V1 =حجم محلول پايه كه بايد برداشته شود. C2 =غلظت DNA در محلول مصرفي. V2 =حجم كل محلول كه بايستي تهيه شود
نمونه هاي DNA‌ اصلي به دماي 20- درجه منتقل شدند.
شکل 2-3 دستگاه اسپکتروفتومتر براي تعيين کميت DNA
2-5 واكنش زنجيره اي پليمراز) (PCR :
واكنش PCR به كمك دستگاه ترموسايكلر انجام شد. حجم نهايي واكنش25 ميكروليتر بود. تركيب مواد استفادهشده در PCR به شرح جدول (2-2) ميباشد.
محلول پايه واکنش PCR، شامل همه مواد موردنياز براي واکنش به جز نمونه DNA بود. ابتدا براساس تعداد نمونه DNAمورداستفاده در هر بار واکنش PCR، نسبتهاي مشخصي از هر يک از اجزاي واکنش برداشته شده و در يک تيوپ به خوبي با هم مخلوط گرديد، سپس به مقدار 22 ميکروليتر از محلول پايه به هر يک از تيوپهايPCR که از قبل3 ميکروليتر از DNAموردنظر در آنها قرار داده شده است، اضافه گرديد. تمامي مراحل آمادهسازي واکنش PCR برروي يخ صورت گرفت. تيوپهاي PCR سپس در دستگاه ترموسايکلر(شکل2-4) قرار داده شدند و مطابق چرخه زماني دادهشده به دستگاه ، واكنش PCR انجام شد. برنامه چرخههاي دمايي واکنش زنجيره پليمراز در جدول (2-3) آمده است. برنامه PCR بصورت time releaseانجام شد.
پس از اتمام PCR نمونه ها از دستگاه خارج و تا انجام الكتروفورز در يخچال نگهداري شدند(40) .
جدول 2-2 تركيب مواد استفاده شده در PCR :
اجزاء واكنش
براي يک نمونه
بافرX 10
lµ 5/2
Forward primer
lµ 5/0
Reverse primer
lµ 5/0
dNTP
lµ 75/0
MgCl2
lµ 1
Taq polymerase
lµ 5/0
Distilled Water
lµ 25/16
DNA
lµ 3
Total
lµ25
جدول 2-3 برنامه PCR
سيكل
تكرار
دما
زمان
1
1
94
3 دقيقه
2
5
94
1 دقيقه
32
1 دقيقه
72
5/1 دقيقه
3
35
94
1 دقيقه
55
1 دقيقه
72
5/1 دقيقه
4
1
72
10 دقيقه
5
4
?
جدول 2-4 پرايمرهاي مورد استفاده در آزمايش:
Sequence (5′-3′)
Type
Primer
5′-TGAGTCCAAACCGGATA-3′
Forward
ME1
5′-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′
Forward
ME2
5′-TGAGTCCAAACCGGAAT-3′
Forward
ME3
5′-TGAGTCCAAACCGGACC-3′
Forward
ME4
5′-TGAGTCCAAACCGGTGC-3′
Forward
EM8
5′-GACTGCGTACGAATTCAAT-3′
Reverse
EM1
5′-GACTGCGTACGAATTCGAC-3′
Reverse
EM3
5′-GACTGCGTACGAATTCTGA-3′
Reverse
EM4
5′-GACTGCGTACGAATTCGCA-3′
Reverse
EM6
5′-GACTGCGTACGAATTCTGC-3′
Reverse
EM2
5′-GACTGCGTACGAATTCGCC-3′
Reverse
EM18
5′-GACTGCGTACGAATTCTCA-3′
Reverse
EM19
5′-GACTGCGTACGAATTCTCC-3′
Reverse
EM20
تعداد 13 آغازگر از دسته آغازگرهاي شرکت سيناژن مورد استفاده قرار گرفت (جدول2-4) اين آغازگرها به صورت خشک فريز شده خريداري شدند که با آب ديونيزه استريل به غلظت pmol100 رقيق شده و در مقادير کمتر در فريزر نگهداري شدند.
شکل2-4 دستگاه ترمو سايکلر مدل verity 96 well Thermal Cycler
2-6 الکتروفورز:
الکتروفورز يک روش آزمايشگاهي براي جداسازي مولکول هاي DNA و پروتئين است. براي انجام اين روش از دستگاهي به نام دستگاه الکتروفورز (شکل2-5) استفاده مي شود. تنوع زيادي در بين دستگاه هاي الکتروفورز وجود دارد، ولي هر دستگاه الکتروفورزي داراي اجزاي ميدان الکتريکي، منبع تغذيه و محيط تفکيک مي باشد.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *